蔣海強(qiáng)+聶磊+李運(yùn)倫+王苗苗+朱梅+楊雯晴+張新雅

[摘要] 選取30只SHR大鼠隨機(jī)分為3組模型組，卡托普利組，清熱降壓膠囊組，wistar大鼠10只作為正常對(duì)照組，連續(xù)給藥14 d后取海馬組織，采用核磁共振（¹H-NMR）代謝組學(xué)方法探討高血壓大鼠的海馬組織損傷以及清熱降壓膠囊的保護(hù)作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)卡托普利組海馬區(qū)代謝輪廓明顯異于其余3組，另3組大鼠樣本分類的趨勢(shì)非常明顯，提示清熱降壓膠囊能顯著改善大鼠海馬組織的代謝，鑒定4種代謝產(chǎn)物為二甲基甘氨酸、甘油磷酸膽堿、醛固酮和去甲腎上腺素。高血壓大鼠機(jī)體代謝異常主要表現(xiàn)在酪氨酸代謝、血管平滑肌收縮以及醛固酮控制的鈉鹽再吸收失常，清熱降壓膠囊在有效降壓的同時(shí)通過(guò)影響這些代謝產(chǎn)物來(lái)改善高血壓的海馬區(qū)損傷。

[關(guān)鍵詞] 高血壓??；清熱降壓膠囊；代謝組學(xué)；海馬

[收稿日期] 2013-07-07

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273700）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81102549）

[通信作者] *李運(yùn)倫，Tel：13869102760，E-mail：li.yunlun@163.com 高血壓?。╡ssential hypertension）是臨床常見(jiàn)病，多發(fā)病，高血壓所導(dǎo)致的小動(dòng)脈病變可造成腦內(nèi)血流減少，供血區(qū)腦組織缺血缺氧，從而影響學(xué)習(xí)和記憶能力[1]。因此對(duì)于高血壓的治療不僅是血壓達(dá)標(biāo)，更多的是對(duì)腦組織損傷的保護(hù)。在長(zhǎng)期高血壓的情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)發(fā)生改變，研究表明自發(fā)性高血壓大鼠4月齡時(shí)海馬CA1區(qū)和齒狀回區(qū)白質(zhì)容積減少，6月齡時(shí)海馬CA1區(qū)和齒狀回區(qū)灰質(zhì)容積及神經(jīng)元數(shù)目減少[2]。因此，高血壓大鼠海馬區(qū)可能存在相應(yīng)的損傷，在高血壓治療的同時(shí)具有保護(hù)海馬區(qū)功能的制劑可能具備良好的開(kāi)發(fā)前景。

清熱降壓膠囊作為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，適用于高血壓病肝火上炎證，其藥味包括黃連、鉤藤、澤瀉和蘆薈，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗高血壓作用，其機(jī)制與降低血漿 Renin 和 AngⅡ含量、提高血漿 cAMP 濃度和降低血容量有關(guān)[3]，能夠干預(yù)高血壓大鼠血漿代謝組整體代謝模式向正常模式轉(zhuǎn)化[4]，因此本實(shí)驗(yàn)采用核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)，從海馬組織小分子代謝物層次研究清熱降壓膠囊對(duì)高血壓大鼠海馬區(qū)的保護(hù)和逆轉(zhuǎn)損傷作用，應(yīng)用模式識(shí)別技術(shù)分析海馬區(qū)的潛在代謝標(biāo)志物，結(jié)合相應(yīng)代謝途徑，從高血壓大鼠海馬區(qū)損傷入手，分析清熱降壓膠囊的靶器官保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）30只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證書(shū)SCXK（京）2006-0009；8周齡雄性Wistar大鼠10只，購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證書(shū)SCXK（魯）2005-1015。

1.2 儀器及試劑 AVANCEⅡ600MHz型超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀，瑞士BRUKER公司產(chǎn)品。清熱降壓膠囊（魯藥制字Z20120009）；卡托普利片（濟(jì)南東風(fēng)制藥有限公司，批號(hào)0608023）；重水（D₂O）為美國(guó)CIL公司產(chǎn)品，2，2，3，3-三甲基甲硅烷基丙酸（3-trimethylsilyl-[2，2，3，3-D4]-propionate，TSP），美國(guó)Aldrich公司產(chǎn)品。

1.3 分組及給藥方法 將SHR大鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，即清熱降壓膠囊組、卡托普利組和模型組，并設(shè)Wistar大鼠10只作為正常對(duì)照組。清熱降壓膠囊組給與18.336生藥g·kg^-1（相當(dāng)于60 kg成年人每日劑量的20倍），卡托普利加生理鹽水適量2.08 g·L^-1混懸液，對(duì)照組給與卡托普利24.96 mg·kg^-1，模型組和正常對(duì)照組給與等量的生理鹽水，按等容積不同濃度的原則灌胃給藥，每天1次，連續(xù)用藥14 d。

1.4 海馬組織的采集及處理 10%水合氯醛（0.35 mL·100 g^-1）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，迅速斷頭取腦，剪開(kāi)頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開(kāi)，迅速分離腦組織，于冰上分離出海馬組織，將體積比為2∶2∶1的甲醇、氯仿和水（4 ℃）按（3 mL· g^-1組織）加入到冷凍的組織中，置組織勻漿管中勻漿3 min，重復(fù)提取2次，合并提取勻漿，將樣品置于4 ℃的冷凍離心機(jī)中以3 000 r·min^-1離心20 min，取上清液置多通道旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，以重水600 μL溶解，加入適量TSP作為內(nèi)標(biāo)，取上層清液550 μL置于5 mm核磁管中，使用AVANCEⅡ600 MHz型超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀進(jìn)行測(cè)量。

1.5 NMR數(shù)據(jù)采集和處理 在超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀上調(diào)用cpmgpr1d脈沖序列，該序列可以較好地去除血液中大分子的干擾，以TSP為化學(xué)位移參考峰位置，設(shè)為0，校正化學(xué)位移，對(duì)圖譜進(jìn)行相位校正和基線校正，將¹H譜按默認(rèn)值，從δ 10.0～0，以每段為0.04進(jìn)行分段并積分，扣除δ 4.5～5處重水中殘余H₂O的影響，共獲得235個(gè)化學(xué)位移小段和各化學(xué)位移對(duì)應(yīng)的積分值，以Excel文件貯存。

1.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)文件采用SIMCA-P軟件 （version 11.5， Umetrics AB， Umea， Sweden） 進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘-判別分析（Partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。根據(jù)PLS-DA分析的VIP圖，尋找對(duì)分類貢獻(xiàn)較大的變量（即化學(xué)位移），確定各組的共性代謝物和組間差異的潛在生物標(biāo)志物。采用MATLAB軟件（The MathWorks，Inc.）進(jìn)行方差分析（ANOVA）。endprint