涂英華 練祖平 謝有科

MTA1沉默抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移能力的體外研究

涂英華 練祖平 謝有科△

目的 探究MTA1基因敲除后對鼻咽癌細(xì)胞株5-8F細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。方法設(shè)計并構(gòu)建針對MTA1基因的RNAi片段，脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）介導(dǎo)Si-MTA1-01（Si-MTA1-01組）和Si-MTA1-02（Si-MTA1-02組）感染5-8F細(xì)胞，同時設(shè)無義序列轉(zhuǎn)染組（Si-ctr組）為對照。應(yīng)用熒光定量PCR和蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的MTAl mRNA和蛋白表達(dá)；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后5-8F細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果與Si-ctr組相比，Si-MTA1-01和Si-MTA1-02組MTA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，穿膜細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞黏附率增加（均P＜0.05），劃痕實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞阻滯效果明顯。結(jié)論沉默MTA1能明顯減弱鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，MTA1有望成為治療鼻咽癌的有效靶點(diǎn)。

鼻咽腫瘤；RNA干擾；細(xì)胞遷移分析；細(xì)胞黏附；細(xì)胞系,腫瘤；印跡法,蛋白質(zhì)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；MTA1；鼻咽癌；5-8F細(xì)胞

鼻咽癌是中國南方和東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，放療是最主要的治療方法。即使經(jīng)過正規(guī)和系統(tǒng)治療,大多數(shù)患者還是死于局部進(jìn)展和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。MTA1是與許多腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)的一個重要基因，有研究顯示鼻咽癌中MTA1基因過表達(dá)，并且與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和患者生存期關(guān)系密切[2-3]。本研究采用RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)抑制鼻咽癌細(xì)胞株MTA1表達(dá)，觀察其對鼻咽癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移能力的影響，探討MTA1成為鼻咽癌治療的新的分子靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細(xì)胞株5-8F由南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所惠贈。RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清為Hyclone原裝進(jìn)口，SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（TaKaRa），Transwell小室（孔徑8 μm）購自Coming公司，纖維連接蛋白（FN）為Sigma公司產(chǎn)品，MTA1多克隆抗體為Epitomics公司產(chǎn)品，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ECL）、β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗、抗兔二抗均為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；RIPA及PMSF蛋白裂解液為碧云天公司產(chǎn)品。Mx3005PTM Real Time PCR儀為Stratagene公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 瞬時轉(zhuǎn)染 設(shè)計及合成針對MTA1基因的siRNA序列：Si-MTA1-01序列5′-GGAGAGATTCGAGTAGGAAAC-3′，Si-MTA1-02序列5′-GCAGCAGAAACGCTTGAAAGC-3′。轉(zhuǎn)染前1 d，接種5-8F細(xì)胞于6孔板中，在細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%匯合度時，將培基換成無血清培基。將稀釋好的干擾片段與LipofectamineTM2000脂質(zhì)體輕柔混勻，室溫孵育20 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；然后將上述混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后更換完全培養(yǎng)基。48～72 h后檢測干擾效率。以Si-ctr（5′-GACGACGATAAGGGATCCTGA-3′，不針對任何已知人mRNA）為對照組。

1.2.2 qRT-PCR檢測干擾效率 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取RNA，檢測RNA濃度和純度后，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒說明進(jìn)行qRT-PCR，GAPDH為內(nèi)參。MTA1引物：上游5′-AGCTACGAGCAGCACAACGGGGT-3′，下游5′-CACGCTTGGTTTCCGAGGAT-3′；GADPH上游5′-TCTTCGCTTTGTCCTTTCGT-3′，下游 5′-TGCTGTAGCCAAATTCG TTG-3′。總反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃10 s、57℃10 s，72℃9 s，45個循環(huán)；95℃1 min、56℃30 s，95℃30 s，繪制熔解曲線。結(jié)果判定采用2－ΔΔCT法：△CT=CT目的基因－CT內(nèi)參，△△CT=△CT處理組－△CT對照組，處理組的相對表達(dá)值=2－△△CT，對照組的相對表達(dá)量=1。各組均設(shè)復(fù)孔3個，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測干擾效率 轉(zhuǎn)染72 h后收集各組細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入RIPA裂解液和PMSF，BCA法蛋白定量，配制10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，每組取25 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠恒壓80 V 30 min，分離膠恒壓100 V 90 min。采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，根據(jù)蛋白Marker所指示的條帶位置，將目的蛋白及內(nèi)參蛋白β-actin所在范圍的膜裁剪下來，放入有封閉液（含5%BSA的TBST）的平皿中浸泡，室溫孵育1 h。用封閉液稀釋一抗，MTA1兔抗人多克隆抗體(1∶250稀釋)和β-actin鼠抗人單克隆抗體（1∶1 000稀釋），室溫孵育1 h后4℃孵育過夜。次日取出膜，TBST洗膜15 min；分別加入HRP標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜15 min。膜稍滴干后置于暗盒內(nèi)，加入化學(xué)發(fā)光試劑孵育，迅速曝光，曝光時間為15 s左右,儀器掃描記錄。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，0.25%胰酶消化，計數(shù)板計數(shù)，每組細(xì)胞密度約為6×106個/mL，接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后棄去培養(yǎng)液，用滅菌槍頭在24孔板底部單層細(xì)胞的中央劃出一劃痕，洗去死細(xì)胞后，換成減半血清完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h和48 h在顯微鏡下拍照。

1.2.5 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，0.25%胰酶消化，無血清培養(yǎng)基洗滌2次后，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加100 μL細(xì)胞懸液于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的上室，然后加500 μL 10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基于下室37℃培養(yǎng)8 h，取出小室，用棉簽輕輕擦掉未穿過膜的細(xì)胞，甲醇固定15 min，Giemsa染液染色5 min，用刀片小心切下聚碳酸酯膜，置于載玻片上，中性樹膠封片，鏡下隨機(jī)讀取5個高倍視野計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值,每組重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 取各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，消化細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，以每組1×104細(xì)胞接種于纖維連接蛋白（FN,1 g/L）包被的96孔板中，每組設(shè)3復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，PBS洗滌未黏附的細(xì)胞，每孔加入含200 μL RPMI 1640培養(yǎng)液基和5 g/L的MTT 20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，室溫孵育10 min，微振蕩器振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白對照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀上490 nm測定各孔密度光度（OD）值。黏附率=處理組OD值/對照組OD值×100%。取平均值,每組重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR和Western blot結(jié)果 與Si-ctr組相比，Si-MTA1-01組和Si-MTA1-02組中MTA1 mRNA分別下降（87.34±4.87）%和（89.07±5.08）%（均P＜0.05）；Western blot亦顯示，Si-MTA1-01組和Si-MTA1-02組MTA1蛋白表達(dá)較Si-ctr組明顯減少，見圖1、2。

2.2 沉默MTA1對5-8F細(xì)胞遷移能力的影響 Sictr組兩側(cè)細(xì)胞愈合較快，邊緣不整齊，而Si-MTA1-01和Si-MTA1-02組兩側(cè)細(xì)胞愈合速度明顯減慢，見圖3。

2.3 干擾MTA1對5-8F細(xì)胞侵襲能力的影響 各組細(xì)胞均穿透Matrigel基質(zhì)膠向下侵襲，Si-ctr組、Si-MTA1-01組和Si-MTA1-02組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為196.6±18.2、68.0±12.3和72.21±14.9，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=68.190，P＜0.01），與Si-ctr組相比，Si-MTA1-01組和Si-MTA1-02組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯減少（均P＜0.05），見圖4。

2.4 下調(diào)MTA1對5-8F細(xì)胞基質(zhì)黏附能力的影響 Si-ctr組、Si-MTA1-01組和Si-MTA1-02組的黏附率分別為（100.00±3.56）%、（164.22±6.09）%和（179.67±9.32）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=117.076，P＜0.01），與Si-ctr組相比，Si-MTA1-01組和Si-MTA1-02組細(xì)胞黏附率明顯增高（均P＜0.05），見圖5。

3 討論

MTA是一類新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤進(jìn)展有關(guān)的基因家族，因最初是在鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌中經(jīng)cDNA庫差異篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)而命名，包括3個在分開的位點(diǎn)編碼的不同基因（MTA1在14q32，MTA2在11q12-q13.1，MTA3在2p21）和幾個選擇性剪接形式（MTA1s，MTA1-ZG29p，MTA3L）[4]。目前的研究熱點(diǎn)主要集中在MTA1基因，MTA1 cDNA全長為2 756 bp，包含1個獨(dú)立閱讀開放框，位于人染色體14q32.3,編碼含703個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[5]。作為核小體重塑和去乙?；?NuRD)復(fù)合物不可缺的亞基之一,MTA1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性被廣泛認(rèn)知[6]。人類多種腫瘤中MTA1表達(dá)均普遍上調(diào)[7],在腫瘤形成及侵襲過程中起著關(guān)鍵作用。MTA1在子宮內(nèi)膜癌[8]、卵巢癌[9]，前列腺腫瘤[10]、乳腺癌[11]、結(jié)腸癌[12]和肺癌[13]等腫瘤中均過度表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。Jiang等[14]發(fā)現(xiàn)沉默MTA1基因表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的增殖和侵襲能力明顯抑制，表明該基因可能在乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮重要作用。Li等[3]運(yùn)用免疫組化分析了208例鼻咽癌組織中MTA1基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示48.6%MTA1蛋白過表達(dá)，其過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，MTA1蛋白表達(dá)程度越高，患者預(yù)后越差，提示MTA1有望成為判斷鼻咽癌預(yù)后的一個新指標(biāo)。Deng等[2]也得出了類似的結(jié)論。但MTA1在鼻咽癌中的作用和機(jī)制仍不清楚。本研究運(yùn)用RNAi沉默5-8F細(xì)胞中MTA1基因表達(dá)，結(jié)果顯示,下調(diào)MTA1基因的表達(dá)后，5-8F細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯越弱，提示沉默MTA1基因能明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力，進(jìn)一步證實(shí)MTA1與鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的可能性。

綜上，沉默MTA1基因表達(dá)后能抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，這表明MTA1基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中起著重要作用。但鼻咽癌的發(fā)生機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，涉及多個癌基因和抑癌基因[15]。MTA1基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中所起的作用必須放在基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)這個大背景中進(jìn)行研究。因此，有必要進(jìn)一步對MTA1基因可能相互作用的蛋白分子及可能參與的信號通路進(jìn)行深入研究。

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（2013-10-11收稿 2013-12-19修回）

（本文編輯 李國琪）

Silencing of MTA1 Attenuates Nasopharyngeal Carcinoma Metastasis in vitro

TU Yinghua,LIAN Zuping,XIE Youke
Department of Oncology,Ruikang Hospital,Guangxi University of Chinese Medicine,Guangxi 530011,China

ObjectiveTo investigate the effects of MTA1 knock down on migration and invasion of NPC cell 5-8F in vitro.Methods RNAi(Si-MTA1-01 and Si-MTA1-02)that can transiently silenced MTA1 was designed,synthesized and transfected into 5-8F cells by lipofectamine 2000.Control group(transfection with nonsense sequence)was also established.The efficiency of MTA1 depletion was determined by q-PCR and Western blot.Wound-healing assay,Matrigel invasion assay and thesolid-phase adhesion assay were performed to investigate the effect of MTA1 knockdown on 5-8F cell metastasis.ResultsTransiently knock down of MTA1 decreased MTA1 transcription and expression in 5-8F cells compared to shRNA-con cells,showing by Real-time PCR and western blot.The invasion and migration of the cells transfected with siRNA-MTA1 were much weaker than the control group(P＜0.05).Conclusionsilencing MTA 1 gene can effectively inhibit the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell,and might be a promising target for NPC treatment.

nasopharyngeal neoplasms;RNA interference;cell migration assays;cell adhesion;cell line,tumor;blotting,Western;reverse transcriptase polymerase chain reaction;MTA1；nasopharyngeal cancer;5-8F cell

R739.6

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.006

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科（郵編530011）

△通訊作者 E-mail:xieyouke_1978@163.com