張 君 榮 曦 吳宇娟 劉 紅

細胞與分子生物學(xué)

短期胰島素刺激對HIT-T15細胞胰島素原基因表達的影響*

張 君 榮 曦 吳宇娟 劉 紅△

目的 探討短期外源性胰島素刺激對HIT-T15胰島β細胞胰島素原（PI）基因表達的影響及機制。方法HIT-T15倉鼠胰島瘤細胞隨機分為4組：含1.4 mmol/L葡萄糖完全培養(yǎng)基組作為空白對照(LG組)，為抑制內(nèi)源性胰島素釋放干擾以低糖聯(lián)合硝苯地平作為條件對照（LGC組），在LGC基礎(chǔ)上分別加0.5 U/L或5 U/L的外源性胰島素作為實驗組(分別為LINS組和HINS組)，分別在刺激后0、30、60、90、120 min以熒光定量PCR檢測各組PI mRNA，免疫組化檢測各組細胞胰島素受體底物1（IRS1）酪氨酸磷酸化水平。結(jié)果（1）LINS組、HINS組細胞PI mRNA表達均上調(diào)，在刺激后60 min PI mRNA表達量達高峰。（2）實驗組在刺激后30 min IRS1酪氨酸磷酸化水平較對照組明顯增高，高、低濃度胰島素組細胞酪氨酸磷酸化達高峰時間不同。（3）LG組和LGC組間PI mRNA表達及IRS1酪氨酸磷酸化水平無明顯差異。結(jié)論短期外源性胰島素能上調(diào)胰島β細胞PI基因的表達，且高濃度的胰島素較低濃度胰島素作用強。PI表達調(diào)控與IRS1信號傳導(dǎo)有關(guān)。

胰島素原；胰島素分泌細胞；硝苯地平；胰島素受體底物1；酪氨酸磷酸化；HIT-T15細胞

胰島素合成與分泌的嚴格而快速的調(diào)控，對維持機體血糖在正常范圍內(nèi)波動至關(guān)重要。胰島β細胞分泌胰島素后，短時間內(nèi)其可通過胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯迅速補充儲存池內(nèi)丟失的胰島素，維持細胞胰島素分泌顆粒的儲存平衡。近期有研究發(fā)現(xiàn)胰島細胞對胰島素有自分泌調(diào)節(jié)作用，葡萄糖刺激后分泌的胰島素可通過與胰島β細胞自身胰島素受體結(jié)合，從而促進胰島素分泌[1]。胰島素的分泌與合成是胰島β細胞維持其自身胰島素代謝平衡的兩大關(guān)鍵細胞生物學(xué)行為。而目前關(guān)于自分泌作用對胰島細胞自身胰島素基因表達的影響還知之甚少。本研究以體外培養(yǎng)HIT-T15倉鼠胰島瘤細胞為研究對象，觀察短期外源性胰島素刺激對胰島β細胞信號傳導(dǎo)元件底物水平磷酸化及胰島素原（proinsulin, PI）基因表達的影響，探討外源性胰島素作用對胰島β細胞自身胰島素合成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 75～80代HIT-T15倉鼠胰島瘤細胞（美國ATCC細胞庫），1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA（GIBCO公司，美國），硝苯地平片（中諾藥業(yè)有限公司），中性胰島素（江蘇萬邦生物醫(yī)藥有限公司），PI基因引物合成、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），胰島素受體底物（IRS）1酪氨酸磷酸化免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司），倒置顯微鏡（Olympus，日本），CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（HERAUESEK Type，德國），細胞培養(yǎng)板（潔特，加拿大），Bio-Rad C1000熒光定量PCR擴增儀(Bio-Rad公司，美國)，Leica病理圖像分析儀（DMR+Q550型，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長的HIT-T15細胞，經(jīng)胰酶消化后以細胞密度為1×106/mL種于6孔板內(nèi)。加入含有10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素，10%FBS，1 mmol/L的丙酮酸鈉及1 mmol/L L-谷氨酰胺的1640培養(yǎng)基（含11.1 mmol/L葡萄糖），置于含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，開始后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組 加入刺激因素前6 h將細胞置于含5.6 mmol/L完全培養(yǎng)基中預(yù)處理。為抑制內(nèi)源性胰島素的干擾，在加入胰島素刺激前30 min加入10 μmol/L硝苯地平刺激。實驗分組：（1）對照組（LG組）。細胞與含1.4 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基作用。（2）硝苯地平組（LGC組）。細胞在含1.4 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基中生長，同時加入10 μmol/L硝苯地平刺激。（3）低胰島素刺激組（LINS組）。細胞與含10 μmol/L硝苯地平及0.5 U/L胰島素的培養(yǎng)基共同作用。（4）高胰島素刺激組（HINS組）。細胞與含10 μmol/L硝苯地平及5 U/L胰島素的培養(yǎng)基共同作用。分別在刺激后0、30、60、90、120 min收取細胞。

1.2.3 PI基因表達檢測 以Trizol試劑抽提培養(yǎng)細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PI引物：上游5′-CGTGGCTTCTTCTACACACCC-3′，下游5′-AGCTCCAGTTGTGCCACTTGT-3′，產(chǎn)物257 bp。內(nèi)參β-actin引物：上游5′-GGAGTTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，產(chǎn)物274 bp。按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明，PCR總反應(yīng)體系20 μL；擴增條件：95℃預(yù)變性30 s，然后95℃變性5 s，60℃退火32 s，60℃延伸1 min條件下循環(huán)40次。采用Bio-Rad C1000熒光定量PCR擴增儀進行檢測。CT值由軟件自動分析獲得，用2-△△Ct法計算分析。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 不同時間點取出的細胞爬片，體積分數(shù)為4%多聚甲醛固定15 min，體積分數(shù)3%H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶。0.25%TritonX-100處理。非免疫動物血清室溫下封閉30 min，滴兔抗大鼠IRS-1酪氨酸磷酸化一抗（1∶400稀釋）；滴加辣根過氧化物酶標記二抗。DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，逐級脫水、透明、封固。鏡下觀察，胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性。采用Leica病理圖像分析儀對所有免疫組化染色標本進行分析。每張玻片均隨機讀取4個不連續(xù)的高倍鏡視野（×400），每個視野讀取10個細胞胞質(zhì)著色處測定灰度值，灰度值與蛋白表達量成反比關(guān)系，灰度值越低，IRS1表達量越高。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（s）表示，多組間比較及組內(nèi)刺激前后比較應(yīng)用單因素方差分析，組間多重比較方差齊時用SNK法，方差不齊時用Games-Howell法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胰島細胞PI mRNA表達水平比較 （1）組內(nèi)比較。隨刺激時間延長兩胰島素刺激組PI mRNA表達量均逐漸升高，在刺激60 min達高峰，隨后逐漸降低。而LG組及LGC組未見上述變化。（2）組間比較。刺激0 min時各組PI mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。刺激30 min及以后各時間點，兩胰島素刺激組PI mRNA表達均較LG組明顯上調(diào)，且HINS組較LINS組上調(diào)更明顯（均P＜0.05）。應(yīng)用Ca2+阻滯劑硝苯地平并不影響PI基因的表達，與LG組相比各時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

Table 1 Comparison of PI mRNA expression at different time points between four groups表1 各組間不同時間點PI mRNA表達比較 （n=3±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01。橫向組內(nèi)比較：a與0 min比較，b與60 min相比，c與90 min相比，P＜0.05?？v向組間比較：d與LG組相比，e與LINS組比較，P＜0.05。表2同

組別LG組LGC組LINS組HINS組F刺激0 min 0.73±0.02 0.69±0.07 0.71±0.07 0.68±0.03 0.557刺激30 min 0.66±0.09 0.73±0.09 0.79±0.02d0.86±0.04ade4.625＊刺激60 min 0.67±0.11 0.68±0.11 1.11±0.06ad1.31±0.04ade27.411＊＊刺激90 min 0.65±0.11 0.63±0.08 0.99±0.08abd1.20±0.10abde59.415＊＊刺激120 min 0.65±0.09 0.64±0.12 0.85±0.06abcd1.13±0.08abde23.296＊＊F 0.499 0.607 22.835＊＊49.586＊＊

2.2 各組IRS1酪氨酸磷酸化水平比較 見表2、圖1。（1）組內(nèi)比較。LINS組、HINS組各時間點較0 min相比均明顯升高（P＜0.05）。兩胰島素刺激組均在刺激30 min后升高，其中LINS組在刺激后60 min、HINS組在刺激后90 min達高峰。LGC組、LG組隨時間延長無明顯改變。（2）組間比較。0 min時各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LINS組自刺激后60 min、HINS組自刺激后30 min明顯高于LG組（P＜ 0.05）。應(yīng)用硝苯地平處理并不影響IRS1磷酸化水平，LG組與LGC組各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Table 2 Comparison of IRS1 tyrosine phosphorylation expression at different time points between four groups表2 各組間不同時間點IRS1酪氨酸磷酸化表達平均灰度值比較 （n=4±s）

注：灰度值越低，IRSI表達量越高

組別LG組LGC組LINS組HINS組F刺激0 min 124.83±2.89 123.28±0.85 124.18±1.51 123.73±1.90 0.468刺激30 min 121.85±1.99 122.08±1.00 118.28±2.72a116.28±1.76ade8.266＊刺激60 min 122.05±1.40 122.05±3.14 116.35±1.00ad117.42±2.21ad8.183＊刺激90 min 121.23±1.96 123.58±2.59 117.35±1.04ad113.48±2.48abde17.742＊＊刺激120 min 120.98±3.44 123.25±1.37 118.83±2.16abd114.20±1.04abde12.672＊＊F 1.582 0.521 11.605＊＊17.590＊＊

3 討論

葡萄糖是促進胰島素分泌的有效刺激因子，調(diào)節(jié)胰島β細胞胰島素的分泌是維持血糖在生理范圍內(nèi)波動的有效方式[2]。早在1980年Verpohl等采用傳統(tǒng)的放射性配體結(jié)合實驗證實了β細胞是胰島素作用的靶細胞。在生理血糖范圍內(nèi)，胰島素與葡萄糖一樣，通過激活胰島β細胞胰島素受體及下游的IRS1/PI3K途徑使β細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而促進胰島素的分泌[3-4]。目前大部分研究多認為胰島素能直接促進胰島β細胞分泌胰島素[5-6]，但此分泌作用是通過調(diào)節(jié)鈣離子通道使胰島β細胞胞吐作用增強引起還是與PI基因表達有關(guān)，目前尚有爭議[7]。

本研究為抑制內(nèi)源性胰島素對實驗干擾，在胰島素刺激前30 min加入鈣離子通道阻滯劑硝苯地平。鈣離子對調(diào)節(jié)胰島素的分泌必不可少。細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高能促進含胰島素顆粒的突觸囊泡向細胞膜移動，促進胰島素以胞吐形式釋放，但不影響胰島素基因表達[8]。本研究中LGC組、LG組PI基因表達無差異，而予高、低2種不同濃度外源性胰島素刺激后PI基因表達量逐漸增加，且隨刺激胰島素濃度的增高而呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，表明胰島素對胰島β細胞PI基因的表達有直接促進作用。但進一步增加胰島素刺激濃度，能否仍然上調(diào)PI基因的表達，有待進一步研究。

IRS是胰島素信號傳導(dǎo)的主要元件，分為IRS1、IRS2。Leibiger等[9]研究表明胰島素能通過順序性激活I(lǐng)RS1及PI3K下游的p70s6k和PKB/AKT途徑分別促進胰島素和葡萄糖激酶的基因轉(zhuǎn)錄和合成，形成胰島β細胞胰島素的自分泌通路，使胰島素能刺激自身的合成。此外IRS1磷酸化也能通過影響細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，而促進胰島細胞脫顆粒，分泌胰島素[10]。IRS1基因敲除的小鼠（IRS1 KO）表現(xiàn)出明顯高胰島素血癥及胰島細胞明顯增生，而PI基因表達量未見明顯增加[11]。由此說明胰島β細胞IRS1酪氨酸磷酸化水平與PI基因表達量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，胰島素刺激后除有PI基因表達量增加外，IRS1酪氨酸磷酸化水平也逐漸升高，其中HINS組IRS1酪氨酸磷酸化水平較LINS組明顯升高，其磷酸化水平峰值時間與PI基因表達基本一致，提示胰島素對胰島β細胞PI基因的調(diào)節(jié)可能是通過IR/ IRS1酪氨酸磷酸化信號通路實現(xiàn)。

在生理狀態(tài)下胰島β細胞能以脈沖的形式分泌胰島素，且這種分泌方式受胰島β細胞產(chǎn)生的多種因子的正反饋調(diào)節(jié)，其中胰島素便是其調(diào)節(jié)因子之一[12]。2型糖尿病患者由于胰島素抵抗及β細胞功能受損使胰島素脈沖式周期分泌節(jié)律失調(diào)[13]。增加外源性胰島素能保持糖尿病患者血糖穩(wěn)定，并在一定程度上能促進胰島細胞功能的恢復(fù)[14]。本研究表明在生理糖濃度條件下短期胰島素刺激對PI基因的表達有正性反饋調(diào)節(jié)作用。基于這一觀點，胰島素除了起到2型糖尿病替代治療作用外，也可能通過對轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)節(jié)，促進胰島素的分泌，從而更好維持血糖平衡。但是否長期刺激后此效應(yīng)仍然存在及這種正反饋如何維持血糖平衡尚有待進一步研究。

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（2013-09-20收稿 2013-12-13修回）

（本文編輯 李國琪）

The Short Term Effect of Insulin on Proinsulin Gene Expression of HIT-T15 Insulinnoma Cells

ZHANG Jun,RONG Xi,WU Yujuan,LIU Hong
Department of Geriatric Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi 530021,China

ObjectiveTo investigate the short term effect of insulin on proinsulin gene expression of HIT-T15 insulinnoma cells（pancreatic islet β-cell）.MethodsThe HIT-T15 cells were randomly divided into four groups.Blank Control Group(LG):complete medium contain 1.4 mmol/L glucose.Control group(LGC)：co-cultured nifedipine with medium in order to restain endogenous insulin release.Experimental group(LINS or HINS)add 0.5 U/L insulin or 5 U/L insulin on top of LGC.After being stimulated for 0,30,60,90,120 mins,proinsulin(PI)mRNA level were assessed by semi-quantitative RT-PCR.Insulin receptor substrate1(IRS1)tyrosine phosphorylation was detected by immunocytochemistry.Results(1) Expression of PI was up regulated by both LINS and HINS,and peak at 60 mins.(2)After stimulation for 30 mins,the level of IRS1 tyrosine phosphorylation in the experimental group was significantly higher than control group,and the peak time between LINS and HINS was different.(3)Between group of LG and LGC,the expression of PI mRNA and IRS1 tyrosine phosphorylation show no difference.ConclusionShort term exogenous insulin stimulation can promote expression of proinsulin genes，which is concentration dependent.The expression and regulation of PI were related with IRS1 signal transduction.

proinsulin;insulin-secreting cells;nifedipine;insulin receptor substrate1;tyrosine phosphorylation; HIT-T15 cells

R587.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.001

*國家自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：31160189）

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年內(nèi)分泌科（郵編530021）

△通訊作者 E-mail：hongmm1@qq.com