田偉,陳榕方,王毅,楊宏偉,方軍,賈治國(guó)

(1、天津市天津醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津300211;2、天津市泰達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津300457)

.實(shí)驗(yàn)研究.

糖化血紅蛋白五種檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

田偉1,陳榕方2,王毅1,楊宏偉1,方軍1,賈治國(guó)1

(1、天津市天津醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津300211;2、天津市泰達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津300457)

目的將糖化血紅蛋白測(cè)定的電泳法、親和層析法、酶法和免疫法和HPLC法進(jìn)行比較及評(píng)估,為臨床醫(yī)師及實(shí)驗(yàn)室在分析不同方法檢測(cè)糖化血紅蛋白結(jié)果時(shí)提供參考.方法正常對(duì)照組45例,DM患者44例,每一份標(biāo)本在同樣條件下用五種方法檢測(cè)HbA1c,記錄測(cè)定結(jié)果,用于對(duì)比分析;選擇具有醫(yī)學(xué)決定水平的正常和異常濃度的樣本,分別采用5個(gè)樣本,批內(nèi)在同一天內(nèi)重復(fù)20次;批間分別在7 d內(nèi)進(jìn)行10次測(cè)試.計(jì)算出批內(nèi)和批間的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和CV值;收集HbA1c高的糖尿病患者的抗凝血,同時(shí)收集當(dāng)天健康者的抗凝血.在各種干擾物不同濃度的影響下,如果HbA1c的值上下浮動(dòng)0.3%,則將視為受到干擾.采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)(以HPLC組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為參照組),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.結(jié)果5種方法中除外硼酸親和法,其他四種方法均符合要求;5種方法在4.0%~14.2%范圍內(nèi)線性良好,實(shí)測(cè)值與理論值的相關(guān)系數(shù)(r)在0.971~0.996之間,其中HPLC法最好;當(dāng)加入各種干擾因素時(shí),結(jié)果顯示HPLC法、酶法、膠乳凝集法測(cè)得的HbA1c值上下浮動(dòng)<0.1%,可見(jiàn)性能穩(wěn)定、不易受到各種干擾物的影響;電泳受溶血影響非常大;硼酸親和法對(duì)溶血標(biāo)本顯示濃度太低時(shí)測(cè)不出數(shù),脂血標(biāo)本顯示濃度太高時(shí)測(cè)不出數(shù);通過(guò)標(biāo)本量、測(cè)定時(shí)間、CV、r等指標(biāo)進(jìn)行比較,HPLC法各種指標(biāo)遠(yuǎn)優(yōu)于其他方法.結(jié)論高校液相色譜法(HPLC)作為金標(biāo)準(zhǔn),批內(nèi)和批間精密度在所采用的5種方法中是最好的,其次為酶法和膠乳凝集法,而硼酸親和法的重復(fù)性則相對(duì)較差.電泳法結(jié)果與實(shí)驗(yàn)人員掃描和對(duì)電泳的波峰判斷有關(guān),主觀隨意性較大,現(xiàn)將HPLC法和電泳法、親和層析法、酶法和免疫法進(jìn)行比較,旨在為臨床醫(yī)師及檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室在分析不同方法檢測(cè)糖化血紅蛋白結(jié)果時(shí)提供參考.

糖化血紅蛋白;糖尿病;檢測(cè)方法;評(píng)價(jià)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象實(shí)驗(yàn)標(biāo)本主要來(lái)自天津市泰達(dá)醫(yī)院體檢中心、內(nèi)分泌科和內(nèi)科門(mén)診及住院病房的被檢者.正常對(duì)照組45例,其中男23例,女22例,年齡24~57歲,為本院體檢無(wú)糖尿病(diabetic mellitus,DM)的健康者;DM患者44例,其中男23例,女21例,年齡45~65歲.以上標(biāo)本均為空腹靜脈采血2ml,EDTAK2抗凝.

1.2 儀器采用美國(guó)伯樂(lè)公司D-10型全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀(HPLC法)、法國(guó)Sebia公司的HYDRASYS型全自動(dòng)蛋白電泳儀(電泳法)、挪威產(chǎn)NycoCard Reader II多功能全定量特種蛋白儀(硼酸親和法)、日立7600型全自動(dòng)生化儀(酶法和膠乳凝集法)分別測(cè)定糖化血紅蛋白.

1.3 試劑D-10型分析儀洗脫緩沖液1、2、3和溶血素/清洗液均由美國(guó)伯樂(lè)公司提供;電泳法的瓊脂糖膠板、染液、加樣梳、溶血素等均由法國(guó)Sebia公司提供;硼酸親和法的試劑盒由上海奧普生物醫(yī)藥有限公司提供;酶法采用的試劑盒由日本的積水醫(yī)療株式會(huì)社提供;膠乳凝集法的膠乳、抗體、緩沖液和溶血?jiǎng)┯杀本?qiáng)申醫(yī)學(xué)科技有限公司提供.并且,各方法試劑均用其公司相應(yīng)批號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)液和質(zhì)控液進(jìn)行定標(biāo)和質(zhì)控監(jiān)測(cè).

1.4 HbA1c檢測(cè)各種檢測(cè)方法的操作均按各自試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.每一份標(biāo)本在同樣條件下用五種方法檢測(cè),記錄測(cè)定結(jié)果,用于對(duì)比分析.

1.5 精密度分析選擇具有醫(yī)學(xué)決定水平的正常和異常濃度的樣本,分別采用5個(gè)樣本,批內(nèi)在同一天內(nèi)重復(fù)20次;批間分別在7d內(nèi)進(jìn)行10次測(cè)試.計(jì)算出批內(nèi)和批間的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和CV值[1].

1.6 線性稀釋分析收集HbA1c高的糖尿病患者的抗凝血,同時(shí)收集當(dāng)天健康者的抗凝血.用0.9%生理鹽水稀釋成5個(gè)濃度梯度的樣本,從低濃度到高濃度做直線回歸分析,觀察其線性范圍[2].

1.7 干擾試驗(yàn)分別在血標(biāo)本中添加56mmo/L葡萄糖、25mmo/L三酰甘油、3.4mmol/L膽紅素,以及,均分別取初始濃度標(biāo)本的1/5、2/5、3/5、4/5、5/5加入樣品進(jìn)行測(cè)試.用低溫凍融方法制備輕度(Hb< 1g/L)、中度(Hb1~4g/L)以及嚴(yán)重溶血標(biāo)本(Hb>5g/L)分別進(jìn)行測(cè)試.在各種干擾物不同濃度的影響下,如果HbA1c的值上下浮動(dòng)0.3%,則將視為受到干擾[2].

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)(以HPLC組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為參照組),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.

2 結(jié)果

2.1 精密度按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)文件要求的批內(nèi)、批間CV應(yīng)小于5%[3],5種方法中除外硼酸親和法,其他4種方法均符合要求;相對(duì)而言,D-10儀的精密度更佳.見(jiàn)表1.

表1 5種方法測(cè)定HbAlc的批內(nèi)及批間精密度結(jié)果

2.2 線性范圍將HbA1c值為10.0的全血用HbA1c值為5.2的血進(jìn)行梯度稀釋,結(jié)果及線性圖如下.見(jiàn)表2.

表2 5種方法線性HbAlc試驗(yàn)結(jié)果

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)當(dāng)加入各種干擾因素時(shí),結(jié)果顯示HPLC法、酶法、膠乳凝集法測(cè)得的HbA1c值上下浮動(dòng)<0.1%,可見(jiàn)性能穩(wěn)定、不易受到各種干擾物的影響;電泳受溶血影響非常大;硼酸親和法對(duì)溶血標(biāo)本顯示濃度太低時(shí)測(cè)不出數(shù),脂血標(biāo)本顯示濃度太高測(cè)不出數(shù).

2.4 對(duì)比試驗(yàn)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所有測(cè)定數(shù)據(jù),得出以高效液相色譜法為自變量(x)、其它4種方法為因變量(Y)的回歸方程及相關(guān)系數(shù)r.另外,通過(guò)標(biāo)本量、測(cè)定時(shí)間、CV、r等指標(biāo)進(jìn)行比較, D-10型各種指標(biāo)遠(yuǎn)優(yōu)于其他方法,見(jiàn)表3.

表3 5種方法測(cè)HbA1c主要參數(shù)比較

3 討論

糖化血紅蛋白(HbA1c)作為糖尿病篩選、診斷、血糖控制范圍、療效考核的有效檢測(cè)指標(biāo),在臨床中得到廣泛的應(yīng)用.檢測(cè)HbA1c的方法很多,有高效液相色譜法、電泳法、親和層析法、酶法和免疫法等.由于高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定HbA1c使其準(zhǔn)確性和重復(fù)性得到很大的提高,被公認(rèn)為監(jiān)測(cè)糖尿病血糖控制的金標(biāo)準(zhǔn)[4].

3.1 精密度由表1可見(jiàn),高效液相色譜法(HPLC)作為金標(biāo)準(zhǔn),批內(nèi)和批間精密度在所采用的5種方法中是最好的,因此法不需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理,全自動(dòng)檢測(cè),人為干擾因素小;其次為酶法和膠乳凝集法,而硼酸親和法的重復(fù)性則相對(duì)較差,因其要求手工操作熟練準(zhǔn)確、加樣精確、層析均勻,故而操作對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定影響.電泳法結(jié)果與實(shí)驗(yàn)人員掃描和對(duì)電泳的波峰判斷有關(guān),主觀隨意性較大,要求實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)嫻熟、經(jīng)驗(yàn)豐富,否則結(jié)果差異較大.

3.2 線性試驗(yàn)觀察表2顯示的數(shù)據(jù)及相應(yīng)的折線圖,可知HPLC法與理論值的相關(guān)性最好,且線性范圍最寬;硼酸親合法的線性圖稍成S形,且濃度越高,偏差越大,可能與其測(cè)定結(jié)果為總的糖化血紅蛋白(所有糖化的血紅蛋白)有關(guān).

3.3 干擾實(shí)驗(yàn)56mmol/L葡萄糖、25mmol/L三酰甘油和3.4mmol/L膽紅素對(duì)HPLC法、酶法和膠乳凝集法均無(wú)干擾,可見(jiàn)性能穩(wěn)定、抗干擾能力較強(qiáng);但是脂血和溶血標(biāo)本對(duì)電泳法和硼酸親和法影響很大-電泳受溶血影響非常大,嚴(yán)重溶血后比溶血前測(cè)得的值要明顯偏低;硼酸親和法對(duì)溶血標(biāo)本顯示濃度太低、脂血標(biāo)本顯示濃度太高,均無(wú)法測(cè)定.

3.4 對(duì)比試驗(yàn)與參考范圍表3的結(jié)果表明,5種方法同時(shí)檢測(cè)同一標(biāo)本時(shí),酶法與HPLC法的結(jié)果最接近.另外,以HPLC法為參比(X),其他4種方法分別為因變量(Y)得出回歸方程并進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),得出各個(gè)txy均大于tα,P<0.05,說(shuō)明各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.5種方法的參考范圍分別為4.5% ~6.3%、3.6%~5.6%、4.5%~6.3%、4.3%~5.8%和3.8%~5.8%.

美國(guó)伯樂(lè)公司的全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀是采用離子交換高效液相色譜分析,可對(duì)血液總血紅蛋白中的HbA1c(%)進(jìn)行分析,利用3種不同濃度洗脫液進(jìn)行梯度分離,將其與其他組分(FP、HbA1a、HbA1b、HbF、HbAO)區(qū)分開(kāi),同時(shí)還測(cè)定出HbA1、HbF的值,并且比較方便于插入急診,CV值小于1%,性能穩(wěn)定不易受到各種共存干擾物的影響,全程自動(dòng)化工作無(wú)人為因素的影響,具有精密度高、測(cè)試速度快、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),為醫(yī)生調(diào)整糖尿病治療方案提供確實(shí)可靠的依據(jù).此方法曾應(yīng)用于美國(guó)糖尿病控制與并發(fā)癥研究,是目前檢測(cè)HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn).D-10檢測(cè)HbA1c能快速準(zhǔn)確地為醫(yī)生提供糖尿病患者血糖控制狀況的信息,從而能妥當(dāng)?shù)卣{(diào)整治療方案,減少因?qū)嶒?yàn)室誤差所帶來(lái)的誤診、誤治.法國(guó)Sebia公司的全自動(dòng)蛋白電泳儀,在工作中發(fā)現(xiàn)測(cè)定糖化血紅蛋白需成批進(jìn)行樣本分析,速度比較慢,無(wú)法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè),自動(dòng)化程度較差,所測(cè)結(jié)果與技術(shù)人員掃描和對(duì)電泳的峰波判斷有關(guān),隨意性較大,且無(wú)急診插入和自動(dòng)維護(hù)等功能,但具有可發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白的功能.硼酸親和層析法,操作簡(jiǎn)便易行、試劑穩(wěn)定,不需貴重儀器,但測(cè)定結(jié)果為總糖化血紅蛋白,與其他方法所測(cè)結(jié)果比較時(shí)應(yīng)注意.酶法和膠乳凝集法都具有相當(dāng)好的重復(fù)性,成本較低,不需要額外添置儀器,但放入儀器之前均需要做離心和混合溶血素的預(yù)處理,相對(duì)D-10儀操作不夠簡(jiǎn)便.

[1]周新,涂植光.臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:33.

[2]楊昌國(guó),許葉.線性評(píng)價(jià)和干擾試驗(yàn)中NCCLS評(píng)價(jià)方案的應(yīng)用[J].臨床檢驗(yàn)雜志,1999,17(3):47-49.

[3]楊昌國(guó),許葉.精密度評(píng)價(jià)和方法比較中NCCLS評(píng)價(jià)方案的應(yīng)用[J].臨床檢驗(yàn)雜志,1999,17(1):184-198.

[4]宋銀丹,段勇.糖化血紅蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,31(2):108-110.

R446.62,R587.1,R446.11+2

A

1674-1129(2014)03-0252-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.007

2013-09-11;

2014-03-28)

田偉,男,1982年出生,本科學(xué)歷,初級(jí)技師,研究方向?yàn)榕R床生物化學(xué)檢驗(yàn).