黎艷培，廖蘊(yùn)華，潘 玲，丁文娟

我國慢性腎臟病(CKD)的患病率已達(dá)到10.8%[1]。鈣磷代謝紊亂是CKD的常見并發(fā)癥，其能增加CKD患者心血管事件的發(fā)生率和病死率。近年來發(fā)現(xiàn)骨-腎-甲狀旁腺軸是鈣磷代謝的重要調(diào)節(jié)軸，成纖維生長因子23(FGF23)、klotho蛋白是該軸的重要組成因子，本研究通過分析不同分期CKD患者FGF23、klotho蛋白、1,25-二羥維生素D3〔1,25-(OH)2D3〕及傳統(tǒng)鈣磷相關(guān)指標(biāo)水平，探討不同時(shí)期CKD患者骨-腎-甲狀旁腺軸相關(guān)因子之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例入選標(biāo)準(zhǔn) 符合美國腎臟基金會慢性腎臟疾病進(jìn)展監(jiān)測與防治指南(National Kidney Foundation-Dialysis Outcomes Quality Initiative，NKF-DOQI)制定的CKD診斷標(biāo)準(zhǔn)及分期[2]，年齡>18歲，未進(jìn)行過腎臟替代治療。

1.2 病例排除標(biāo)準(zhǔn) 合并急性腎損傷，系統(tǒng)性自身免疫性疾病導(dǎo)致的腎炎，原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，肝膽疾患，既往6個(gè)月內(nèi)使用免疫抑制劑治療，近1個(gè)月內(nèi)規(guī)律使用鈣劑、磷結(jié)合劑及維生素D制劑者。

1.3 臨床資料 選擇2012年10月—2013年3月于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的符合研究標(biāo)準(zhǔn)的137例CKD非透析患者，其中男75例、女62例，平均年齡(46.0±14.1)歲。CKD病因構(gòu)成：原發(fā)性腎小球疾病97例(70.8%)，高血壓腎損害20例(14.6%)，糖尿病腎病11例(8.0%)，高尿酸性腎病7例(5.1%)，梗阻性腎病2例(1.5%)。選擇同期于我院體檢中心行體檢健康者35例為對照組，其中男14例、女21例，平均年齡(40.4±15.2)歲。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法 收集兩組受試者的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、血壓、CKD病因。受試者清晨空腹抽取靜脈血，3 000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)，取上清，于-80 ℃冰箱儲存。使用日本日立7600型血生化自動分析儀檢測血肌酐、清蛋白、血鈣、血磷、血堿性磷酸酶(ALP)，采用放射免疫法檢測全段甲狀旁腺激素(iPTH)。患者血鈣經(jīng)過校正，校正鈣(mmol/L)=血測定鈣(mmol/L)+0.2×〔4-0.1×清蛋白(g/L)〕。FGF23、klotho蛋白、1,25-(OH)2D3的檢測采用ELISA雙夾心法，試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。根據(jù)改良簡化MDRD公式計(jì)算估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)。根據(jù)eGFR 將CKD組分為4組：CKD 1～2期組〔eGFR≥60 ml·min-1·(1.73 m2)-1〕、CKD 3期組〔eGFR 30～59 ml·min-1·(1.73 m2)-1〕、CKD 4期組〔eGFR 15～29 ml·min-1·(1.73 m2)-1〕、CKD 5期組〔eGFR <15 ml·min-1·(1.73 m2)-1〕。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較 CKD各組及對照組的性別構(gòu)成間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11)，CKD 1～2期組年齡低于CKD其他分組(P<0.05)。CKD 1～2期組血清iPTH、ALP、FGF23水平與對照組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CKD 3、4、5期組血清iPTH、ALP、FGF23水平較對照組升高，1,25-(OH)2D3水平較對照組降低(P<0.05)，其中CKD 4、5期組iPTH、FGF23較CKD 3期升高，且CKD 5期又高于CKD 4期(P<0.05)，ALP、1,25-(OH)2D3水平CKD 3、4、5期組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CKD 4、5期血鈣較對照組降低，血磷、klotho蛋白較對照組升高(P<0.05)，其中CKD 5期組血磷又較CKD 4期升高(P<0.05)，CKD 4、5期組血鈣、klotho蛋白水平間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2 單因素相關(guān)分析 將年齡、BMI、平均動脈壓(MAP)、清蛋白、血紅蛋白、血鈣、血磷、iPTH、eGFR、ALP、1,25-(OH)2D3、klotho蛋白、膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)與FGF23進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)GF23與血磷(r=0.432，P<0.001)、iPTH(r=0.409，P<0.001)、ALP(r=0.372，P<0.001)、klotho蛋白(r=0.383，P<0.001)、MAP(r=0.276，P<0.001)呈正相關(guān)；與eGFR(r=-0.600，P<0.001)、血鈣(r=-0.192，P=0.012)、1,25-(OH)2D3(r=-0.228，P=0.003)、HDL(r=-0.252，P=0.001)、清蛋白(r=-0.273，P<0.001)、血紅蛋白(r=-0.449，P<0.001)呈負(fù)相關(guān)。

2.3 多元逐步線性回歸分析 以lgFGF23為因變量,以血磷、iPTH、ALP、klotho蛋白、MAP、eGFR、血鈣、1,25-(OH)2D3、HDL、清蛋白、血紅蛋白、性別、病因?yàn)樽宰兞窟M(jìn)行多元逐步回歸分析，被篩選引入方程的因素有：eGFR、血磷、klotho蛋白、HDL，經(jīng)檢驗(yàn)F=32.966，P<0.001,此4項(xiàng)因素對lgFGF23影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型的R2為0.447，調(diào)整R2為0.434，其余檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值見表2。從標(biāo)準(zhǔn)化偏回歸系數(shù)看，對lgFGF23影響效果由大到小的因素依次是eGFR、血磷、klotho蛋白、HDL?；貧w方程為：lgFGF23=1.239-0.331eGFR蛋白+0.310血磷+0.173klotho蛋白-0.151HDL。

表1 不同CKD組及對照組一般資料及鈣磷代謝指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與CKD 1～2期組比較，△P<0.05；與CKD 3期組比較，▲P<0.05；與CKD 4期組比較，○P<0.05；★為χ2值，☆為F值，◆為H值；eGFR=估算腎小球?yàn)V過率，iPTH=全段甲狀旁腺激素，ALP=堿性磷酸酶，F(xiàn)GF23=成纖維生長因子-23，1,25-(OH)2D3=1，25-二羥維生素D3

表2 FGF23影響因素的多元逐步線性回歸分析

Table2 Multiple linear regression analysis on influencing factors for FGF23

影響因素偏回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤標(biāo)化偏回歸系數(shù)t值P值常數(shù)項(xiàng)1 2390 10611 641<0 01eGFR-0 0030 001-0 331-4 649<0 01血磷0 2850 0600 3104 740<0 01klotho蛋白0 1720 0620 1732 760<0 01HDL-0 0820 033-0 151-2 4900 014

注：HDL=高密度脂蛋白

3 討論

FGF23/klotho蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的在鈣磷代謝中起著關(guān)鍵作用的因子，F(xiàn)GF23/klotho蛋白、1,25-(OH)2D3、PTH之間形成骨-腎-甲狀旁腺調(diào)節(jié)軸，共同調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷代謝的平衡。正常生理情況下，骨原細(xì)胞及成骨細(xì)胞分泌的FGF23與腎臟klotho-FGFR1結(jié)合后,抑制近曲小管刷狀緣2a型及2c型鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NaPi-2a/NaPi-2c)促進(jìn)磷的排泄[3]；當(dāng)血磷升高時(shí)，刺激FGF23的生成。FGF23還抑制PTH及1,25-(OH)2D3的生成,而PTH刺激FGF23及1,25-(OH)2D3的生成，升高的1,25-(OH)2D3反過來抑制PTH的生成，同時(shí)進(jìn)一步刺激FGF23及klotho蛋白的產(chǎn)生，間接抑制PTH的生成，由此，骨-腎-甲狀旁腺之間的正負(fù)反饋形成[4]。CKD時(shí)此軸紊亂，可導(dǎo)致一系列礦物質(zhì)及骨代謝紊亂。

本研究中，CKD 3、4、5期組FGF23、iPTH、ALP、1,25-(OH)2D3水平較對照組發(fā)生明顯改變，而血鈣、血磷及klotho蛋白則在CKD 4～5期組發(fā)生明顯改變，說明FGF23、iPTH、ALP、1,25-(OH)2D3等水平改變要早于血鈣、血磷及klotho蛋白?；录t娣等[5]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF23在CKD 3期后水平逐期升高，而1,25-(OH)2D3在CKD 3期后明顯下降，但CKD 3、4期及腹膜透析組組間無明顯差異，本研究結(jié)果與之相似。國外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF23在CKD 1～2期呈基線水平，當(dāng)eGFR<47 ml·min-1·(1.73 m2)-1后升高，升高的FGF23與全因死亡率及心血管事件發(fā)生率有著很好的相關(guān)性，而血清鈣磷水平在eGFR>40 ml·min-1·(1.73 m2)-1前無明顯改變[6-8]。本研究顯示，F(xiàn)GF23自eGFR<60 ml·min-1·(1.73 m2)-1后開始出現(xiàn)升高。CKD患者中FGF23水平升高的具體機(jī)制尚未十分明確，有觀點(diǎn)認(rèn)為，CKD患者隨著腎單位的喪失及各種代謝的紊亂，腎臟中FGF23的特異性共受體膜結(jié)合型klotho蛋白(FGF23須通過其產(chǎn)生作用)減少，造成FGF23抵抗，削弱FGF23的促磷排泄及抑制PTH分泌的正常功能；此外，高磷血癥、甲狀旁腺功能亢進(jìn)均進(jìn)一步刺激FGF23的生成，打破骨-腎-甲狀旁腺之間的調(diào)節(jié)軸，形成惡性循環(huán)[9]。1,25-(OH)2D3減少在CKD早期便已存在，隨著eGFR的下降呈線性下降，eGFR每減少1個(gè)單位1,25-(OH)2D3水平下降0.3 ng/L，本研究中1,25-(OH)2D3水平在CKD 3期后才出現(xiàn)變化，但在CKD 3、4、5期組間兩兩比較無明顯差異，提示CKD 3期后1,25-(OH)2D3未進(jìn)一步下降，可能與種族、生活方式及CKD 1～2期組患者相對年輕有關(guān)。Regidor等[10]在對73 960例透析患者的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)， ALP升高，尤其是ALP≥120 U/L后顯著增加了患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，本研究中ALP水平在CKD 3期后已逐步升高，血清中的ALP主要來自肝臟和骨骼，本研究排除了肝膽疾病患者，提示升高的ALP部分可能來自于成骨細(xì)胞，由于本研究測定的是總ALP水平，不能準(zhǔn)確評估成骨細(xì)胞活性，因此建議CKD 3期后加測骨特異性堿性磷酸酶水平。

本研究顯示，eGFR、血磷、klotho蛋白、HDL是FGF23的獨(dú)立影響因素。隨著腎功能的下降FGF23升高已普遍達(dá)成共識。高血磷是FGF23生成的刺激因素，Ito等[11]對健康志愿者靜脈注射磷酸鹽，使血磷快速升高，6 h后留血測定FGF23水平，發(fā)現(xiàn)FGF23水平并無改變；另一項(xiàng)研究對CKD 4期患者予司維拉姆8周的干預(yù)，結(jié)果顯示可降低FGF23水平[12]，而予碳酸鑭2周干預(yù)并不降低FGF23水平[13]，提示短時(shí)間內(nèi)血磷急劇改變可能并不調(diào)節(jié)FGF23的分泌，長期的磷負(fù)荷或可影響FGF23水平。本研究中FGF23的改變較血磷早，提示早期測定FGF23水平有助于評估體內(nèi)磷負(fù)荷情況。

本研究血清klotho蛋白與FGF23呈正相關(guān)，考慮與膜結(jié)合型klotho蛋白的減少導(dǎo)致FGF23抵抗有關(guān)。klotho蛋白分為膜結(jié)合型及分泌型，膜結(jié)合型存在于腎遠(yuǎn)曲小管，血液中存在的klotho蛋白可來源于酶切的膜結(jié)合型klotho蛋白胞外段及分泌型klotho蛋白，在部分CKD研究中血清klotho蛋白是降低的，而本研究中該蛋白從CKD 4期后升高，與Sugiura等[14]及Devaraj等[15]的研究結(jié)果類似。由于klotho蛋白在人體多個(gè)器官均有表達(dá)，猜測可能與腎單位受損后腎外組織代償性生成有關(guān)，需進(jìn)一步行組織中klotho蛋白檢測證實(shí)。

本研究顯示，HDL與FGF23呈負(fù)相關(guān)。HDL是公認(rèn)的抗動脈粥樣硬化因子，具有抗氧化應(yīng)激作用[16]，而CKD患者脂代謝紊亂及氧化應(yīng)激較普遍，控制HDL水平是否有助于改善FGF23水平仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，CKD患者FGF23、iPTH、ALP、1,25-(OH)2D3水平改變早于血鈣、血磷、klotho蛋白；eGFR、血磷、klotho蛋白、HDL是FGF23的獨(dú)立影響因素。由于本研究為橫斷面研究，未能了解骨-腎-甲狀旁腺軸相關(guān)因子對患者預(yù)后的影響，有待日后開展進(jìn)一步的隊(duì)列研究。

1 Zhang L,Wang F,Wang L,et al.Prevalence of chronic kidney disease in China:A cross-sectional survey[J].Lancet,2012,379(9818):815-822.

2 Levey AS,Coresh J,Balk E,et al.National Kidney Foundation practice guidelines for chronic kidney disease:Evaluation,classification,and stratification[J].Ann Intern Med,2003,139(2):137-147.

3 Miyamoto K,Ito M,Tatsumi S,et al.New aspect of renal phosphate reabsorption:The type IIc sodium-dependent phosphate transporter[J].Am J Nephrol,2007,27(5):503-515.

4 Hu MC,Shiizaki K,Kuro-o M,et al.Fibroblast growth factor 23 and klotho:Physiology and pathophysiology of an endocrine network of mineral metabolism[J].Annu Rev Physiol,2012,75:503-533.

5 宦紅娣,張軍力,張景紅,等.慢性腎臟病患者鈣磷代謝及調(diào)節(jié)因子的變化[J].臨床內(nèi)科雜志,2008,25(11):743-746.

6 Isakova T,Xie H,Yang W,et al.Fibroblast growth factor 23 and risks of mortality and end-stage renal disease in patients with chronic kidney disease[J].JAMA,2011,305(23):2432-2439.

7 Pavik I,Jaeger P,Ebner L,et al.Secreted Klotho and FGF23 in chronic kidney disease stage 1 to 5:A sequence suggested from a cross-sectional study[J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(2):352-359.

8 Levin A,Bakris GL,Molitch M,et al.Prevalence of abnormal serum vitamin D,PTH,calcium,and phosphorus in patients with chronic kidney disease:Results of the study to evaluate early kidney disease[J].Kidney Int,2007,71(1):31-38.

9 Bernheim J and Benchetrit S.The potential roles of FGF23 and Klotho in the prognosis of renal and cardiovascular diseases[J].Nephrol Dial Transplant,2011,26(8):2433-2438.

10 Regidor DL,Kovesdy CP,Mehrotra R,et al.Serum alkaline phosphatase predicts mortality among maintenance hemodialysis patients[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2193-2203.

11 Ito N,Fukumoto S,Takeuchi Y,et al.Effect of acute changes of serum phosphate on fibroblast growth factor(FGF)23 levels in humans[J].J Bone Miner Metab,2007,25(6):419-422.

12 Yilmaz MI,Sonmez A,Saglam M,et al.Comparison of calcium acetate and sevelamer on vascular function and fibroblast growth factor 23 in CKD patients:A randomized clinical trial[J].Am J Kidney Dis,2012,59(2):177-185.

13 Isakova T,Gutierrez OM,Smith K,et al.Pilot study of dietary phosphorus restriction and phosphorus binders to target fibroblast growth factor 23 in patients with chronic kidney disease[J].Nephrol Dial Transplant,2011,26(2):584-591.

14 Sugiura H,Tsuchiya K，Nitta K.Circulating levels of soluble alpha-Klotho in patients with chronic kidney disease[J].Clin Exp Nephrol,2011,15(5):795-796.

15 Devaraj S,Syed B,Chien A,et al.Validation of an immunoassay for soluble Klotho protein: Decreased levels in diabetes and increased levels in chronic kidney disease[J].Am J Clin Pathol,2012,137(3):479-485.

16 翟振麗，馬維紅，申煒.高密度脂蛋白與動脈粥樣硬化的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2013，16(12)：4242-4245.