丁 寧 李 坤* 常 明

增強型綠色熒光蛋白融合人核糖核酸*酶抑制因子包裝細胞系的建立及鑒定

丁 寧①李 坤①*常 明①

目的：建立及鑒定產(chǎn)生綠色熒光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子(hRI)的PA317包裝細胞系。方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pLNCX-EGFP-C1-hRI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PA317包裝細胞，分為空白細胞組(未轉(zhuǎn)染組)、pLNCX-EGFP-C1轉(zhuǎn)染組(對照組)、pLNCX-EGFP-C1-hRI轉(zhuǎn)染組(實驗組)，每組設(shè)3個復孔，轉(zhuǎn)然后用RT-PCR和Western blot方法檢測egfp-hRI基因在PA317細胞的表達。結(jié)果：RT-PCR和Western blot方法顯示，轉(zhuǎn)染后在PA317細胞中檢測到egfp-hRI基因表達；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法獲得了G418陽性的PA317包裝細胞克隆。結(jié)論：實驗成功建立了產(chǎn)生綠色熒光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的PA317包裝細胞系，為后續(xù)試驗奠定了基礎(chǔ)。

人核糖核酸酶抑制因子；增強型綠色熒光蛋白；鑒定

丁寧,女,(1977- ),碩士，實驗師。大連大學醫(yī)學院醫(yī)學檢驗實驗中心，從事腫瘤分子生物學及臨床生化檢測相關(guān)研究。

[First-author’s address]Department of Biochemistry, Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China.

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生是多因素、多階段及長時間積累造成的癌基因激活、抑癌基因缺失或失活的基因病。因而，目前對腫瘤的治療趨向于靶向分子治療和創(chuàng)新藥物的探索等。其中深入了解靶基因的功能，尋找要害靶分子，對之實施打擊或補充是研究的主要內(nèi)容。人核糖核酸酶抑制因子(human ribonuclease inhibitor，hRI)是相對分子質(zhì)量為50×103的酸性糖蛋白，廣泛存在于細胞的可溶性部分。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)實體腫瘤能分泌血管生成素(angiogenin，Ang)，刺激血管的形成來供應癌細胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移。而hRI則具有與Ang緊密結(jié)合并抑制其活性的功能[1]。另一方面研究數(shù)據(jù)顯示，hRI與Ang結(jié)合后，可抑制實體瘤血管的形成，從而抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移[2]。因此，hRI能否成為有效的靶向治療藥物一直是本實驗組致力研究的課題。

為深入揭示hRI作為靶向分子治療的作用機制，本研究構(gòu)建了針對人RI基因的pLNCX-EGFP-C1-hRI載體[3]。為進一步驗證該載體的作用效果，本實驗用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pLNCX-EGFP-C1-hRI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PA317包裝細胞，用RT-PCR和Western blot檢測EGFP-hRI基因在PA317細胞的表達情況，為下一步實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1)反轉(zhuǎn)錄病毒pLNCX質(zhì)粒購自美國CLONTECH公司；pLNCX-EGFP-C1-hRI質(zhì)粒由本實驗室前期構(gòu)建；PA317包裝細胞購自中國科學院上海細胞庫。

(2)DL2000 DNA Marker、凝膠產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒中量提取試劑盒、DEPC處理水購自寶生物工程(大連)有限公司；Trizol、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青血清生物制品有限公司；PVDF(聚偏二氟乙烯)膜購自美國BD Biosciences公司；RT-PCR kit、ECL化學發(fā)光顯色試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗人核糖核酸酶抑制因子抗體由本實驗室制備；RIPA蛋白裂解液購自南京KEYGEN凱基生物。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

PA317細胞在含10%胎牛血清、青霉素(100 μg/ ml)及鏈霉素(100 μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基置于5%的CO2、37 ℃和90%濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞按0.5×105～2.0×105鋪板于24孔板中，至細胞達到融合度約80%左右時用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。分空白細胞組(未轉(zhuǎn)染組)、pLNCX-EGFP-C1轉(zhuǎn)染組(對照組)、pLNCXEGFP-C1-hri轉(zhuǎn)染組(實驗組)，每組3復孔。轉(zhuǎn)染后72 h用新霉素篩選兩周，獲得單克隆、增殖、收獲細胞，并觀察陽性重組質(zhì)粒在PA317細胞中的表達。

1.3 RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后PA317細胞中RI基因轉(zhuǎn)錄水平變化

采用Trizol試劑提取各組細胞的總RNA。使用RT-PCR試劑盒按照兩步法進行RT-PCR反應，以總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR反應，引物序列見表1。

表1 RT-PCR實驗引物序列

PCR反應條件為：94 ℃，2 min，1個循環(huán)。94℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30個循環(huán)次。72℃，4 min；1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由Bio-Rad凝膠成像儀檢測后用Image LAbTM軟件進行分析。用目的蛋白條帶灰度值與β-肌動蛋白條帶灰度值的比值表示目的基因的相對表達水平。

1.4 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后PA317細胞中RI蛋白表達水平

用胰酶消化細胞，以轉(zhuǎn)速為1000 r/min離心10 min，經(jīng)PBS洗2次后用含1 mM PMSF的RIPA蛋白裂解液提取蛋白，然后BCA法蛋白定量。各泳道取60 μg蛋白上樣進行電泳、轉(zhuǎn)膜，5%小牛血清封閉2 h，一抗孵育，4 ℃過夜；第2 d用TBST洗滌3次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌4次后用ECL化學發(fā)光試劑盒發(fā)光。曝光時間30 s，由Bio-Rad凝膠成像儀攝取凝膠圖像，用Image LAbTM軟件進行分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，樣本顯著性分析用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測hRI基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達

RT-PCR半定量分析顯示，空白組(未轉(zhuǎn)染組)及對照組細胞的RI基因和內(nèi)參β-肌動蛋白基因產(chǎn)物條帶分別是527和300 bp，且對照組比空白組hRI基因相對表達強度增加。pLNCX-EGFP-C1-hRI轉(zhuǎn)染組細胞EGFP-hRI融合基因和內(nèi)參β-肌動蛋白基因產(chǎn)物條帶分別是583和300 bp，其EGFP-hRI基因相對表達強度比空白組及對照組增強(如圖1所示)。

圖1 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染的EGFP-hRI基因在PA317細胞中的表達

2.2 Western blot檢測hRI基因在蛋白質(zhì)水平上的表達

Western blot檢測hRI基因在蛋白質(zhì)水平上的表達結(jié)果顯示，空白組(未轉(zhuǎn)染組)、對照組細胞可見hRI基因和內(nèi)參β-肌動蛋白基因條帶，且對照組比空白組hRI基因相對表達強度增加；pLNCX-EGFP-C1-hRI轉(zhuǎn)染組細胞可見EGFP-hRI基因和內(nèi)參β-肌動蛋白基因條帶，其EGFP-hRI基因相對表達強度比空白組及對照組增加。此結(jié)果與RT-PCR一致(如圖2所示)。

圖2 Western blot檢測EGFP-hRI在PA317細胞中的表達

3 討論

hRI位于胞漿內(nèi)，是體內(nèi)一種重要的調(diào)控蛋白，具有多方面調(diào)節(jié)作用[4]。其定位于染色體11 p15.5區(qū)，相對分子質(zhì)量約50×103。在1級結(jié)構(gòu)上，RI由460個氨基酸殘基組成，87%的氨基酸組成7個重復單位，兩個重復單位之間的平均同源性為39%[5]。每個重復單位中又包括α、β兩種亮氨酸重復單位(leucine-rich repeats，LRRs)。目前國內(nèi)外研究顯示，LRRs結(jié)構(gòu)域與膜和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)等相互作用有關(guān)[6]。文獻查閱表明，含有LRRs重復結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)顯示了廣泛的功能，包括細胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復、細胞外基質(zhì)的相互作用等[7-8]。人正常細胞內(nèi)的RI主要具有以下功能：①抑制核糖核酸酶A(RNase A)的活性。在中性及堿性環(huán)境下與RNase A以1∶1化學計量比緊密結(jié)合，抑制其酶活性，從而保護mRNA和rRNA，促進蛋白質(zhì)合成[9]；②抑制腫瘤血管的形成，RI能與Ang緊密結(jié)合(Ki=7.1×10-16mol/L)，從而抑制實體瘤血管的形成，抑制瘤體生長[10-11]；③RI具有抗機體氧化損傷的功能[12]。RI其活性中心結(jié)構(gòu)中富含還原狀態(tài)的巰基，能夠減輕H2O2等引起的細胞過氧化損傷，抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等[13-15]。

綜上所述，RI可作為抗腫瘤治療的重要靶向藥物，可能為抑制腫瘤生長發(fā)揮重要作用。為進一步探討其作用機制，本研究構(gòu)建了針對hRI基因的表達載體pLNCX-EGFP-C1-hRI(綠色熒光蛋白融合hRI基因載體)并將其轉(zhuǎn)染到PA317細胞中。RT-PCR和Western blot檢測EGFP-hRI基因在轉(zhuǎn)錄后水平和蛋白質(zhì)水平的表達情況：EGFP蛋白相對分子質(zhì)量約為29×103，EGFP融合hRI蛋白相對分子質(zhì)量約為79×103。證明EGFP-hRI基因被正確大量表達，從而說明成功建立了產(chǎn)生綠色熒光蛋白融合hRI的PA317包裝細胞系，為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。

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Identification of the expression of recombinated plasmid pLNCX-EGFP-C1-hRI in PA317 packaging cell line/

DING Ning, LI Kun, CHANG Ming// China Medical Equipment, 2014,11(9):9-11.

Objective:To identify the expression of plasmid pLNCX-EGFP-C1-hRI targeting the gene of Human ribonuclease inhibitor (hRI) in PA317 cells which is capable of expression in mammalian cells.Methods:The vector of pLNCX-EGFP-C1-hRI was transfected into PA317 cells by Lipofectamine 2000 and then the expression of recombinated plasmid was verified in living cells by observing the transcription level of egfp-hRI fusion gene mRNA with RT-PCR method and the expression level of egfp-fusion hRI protein with western blotting method respectively.Results:Both RT-PCR and western blotting showed the egfp-hRI fusion gene was obviously expression in PA317 cells.Conclusion:The plasmid of pLNCX-EGFP-C1-hRI targeting hRI is successfully constructed and the protein of hRI can be expressed in PA317 cells correctly.

Human ribonuclease inhibitor; Enhanced green fluorescent protein; Identification

1672-8270(2014)09-0009-03

R392.11

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.09.004

2014-06-26

遼寧省教育廳科研課題(L2011219)“阻斷內(nèi)源性Angiogenin釋放在抗肝癌血管生成中的應用研究”

①大連大學醫(yī)學院醫(yī)學檢驗實驗中心 遼寧 大連 116600

*通訊作者：likun197289@163.com