劉 琳，郝曉明，董 會(huì)，歐 元，趙興春，葉 健

（1.中國(guó)人民公安大學(xué)，北京100038；2.重慶市公安局巴南區(qū)分局，重慶401320；3.法庭科學(xué)生物芯片工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；4.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

自20世紀(jì)90年代以來，以PCR-STR技術(shù)為代表的第二代法醫(yī)DNA分型技術(shù)在司法實(shí)踐中的應(yīng)用日益廣泛，整個(gè)DNA分型過程包括DNA提取、定量、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)與分析，其中DNA提取與PCR擴(kuò)增是兩個(gè)重要的限速步驟，常規(guī)方法難以滿足DNA數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模不斷擴(kuò)大和緊急案件檢驗(yàn)的需求。本文選用AmpF?STRIdentifilerPlus試劑盒與TaKaRa公司的快速PCR試劑盒聯(lián)合建立快速直接PCR（Rapid Direct PCR[1]）反應(yīng)體系，采用免提取的方式，以FTA血卡為模板，采用經(jīng)優(yōu)化的熱循環(huán)參數(shù)在快速PCR儀上完成擴(kuò)增，對(duì)如何縮短DNA分型檢測(cè)的時(shí)間進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 樣本

FTA血卡樣本（公安部物證鑒定中心提供）

1.2 主要儀器及試劑

1.3 PCR擴(kuò)增方法

1.3.1 快速直接PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)分為四組，第一組：10 μL反應(yīng)體系，直徑0.5 mm FTA血卡為模板；第二組：10 μL反應(yīng)體系，直徑1.0mm FTA血卡為模板；第三組：20 μL反應(yīng)體系，直徑0.5 mm FTA血卡為模板；第四組：20 μL反應(yīng)體系，直徑1.0mm FTA血卡為模板。

四組所用熱循環(huán)參數(shù)：95℃ 3 min；95℃ 10 s，59℃ 15 s，72℃ 20 s，29 個(gè)循環(huán)；72℃ 3 min；25℃保存。擴(kuò)增總用時(shí)55min。

1.3.2 常規(guī)直接PCR擴(kuò)增

1.4 電泳及數(shù)據(jù)分析

取上述各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1μL分別與10μL上樣混合物（20μL GeneScan LIZ500內(nèi)標(biāo) +1000μL去離子甲酰胺）混合，用3130XL遺傳分析儀，按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行電泳分離，采用GeneMapper ID V 3.2軟件進(jìn)行基因分型。

圖1 10μL反應(yīng)體系，直徑0.5mm FTA血卡為模板

2 結(jié)果與討論

如何縮短DNA分型檢測(cè)時(shí)間一直是法醫(yī)界學(xué)者們研究的焦點(diǎn)之一，例如，Verheij[2]等在 2012年將Thermo快速PCR試劑盒與AmpF?STRSGM PlusTM、AmpF?STRIdentifiler、AmpF?STRSEfilerPlusTM、AmpF?STRNGMTM分別組合，探索快速直接PCR擴(kuò)增在法庭科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖2 10μL反應(yīng)體系，直徑1.0mm FTA血卡為模板

圖3 20μL反應(yīng)體系，直徑0.5mm FTA血卡為模板

3 結(jié)論

參考文獻(xiàn)：

[1]Aboud M，Oh HH，McCord B.Rapid Direct PCR for Forensic genotyping in under 25 minutes[J].Electrophoresis，2013，34（11）：1539-1547.

[2]Verheij S， Harteveld J， Sijen T.A protocol for direct and rapid multiplex PCR amplification on forensically relevant samples[J].Forensic Science International： Genetics， 2012，6（2）：167-75.