張志勤，李 玫，朱昌輝，王 棟，韓國柱，唐澤耀（.大連市皮膚病醫(yī)院，遼寧大連 60；.大連醫(yī)科大學藥理教研室，遼寧大連 6044）

RP-HPLC法同時測定復方維A酸乳膏中尿囊素、維A酸、異維A酸和維生素E的含量

張志勤1＊，李 玫2，朱昌輝1，王 棟1，韓國柱2，唐澤耀2（1.大連市皮膚病醫(yī)院，遼寧大連 116021；2.大連醫(yī)科大學藥理教研室，遼寧大連 116044）

目的：建立同時測定復方維A酸乳膏中尿囊素、維A酸、異維A酸和維生素E含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為ODSSyncronis C18，流動相為甲醇-水-0.5%冰醋酸（梯度洗脫，采用不同的流速和檢測波長），進樣量為20μl，柱溫為35℃。結果：尿囊素、維A酸、異維A酸、維生素E的檢測質量濃度分別在125～2 000、12.5～200、6.25～100、250～4 000μg/m l范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關系（r＝0.999 8、0.999 9、0.999 8、0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD≤0.88%；平均加樣回收率分別為99.5%、97.6%、99.8%、99.0%，RSD分別為0.24%、0.97%、0.18%、0.72%（n＝6）。結論：該方法操作簡便、快速、準確，適用于同時測定復方維A酸乳膏中尿囊素、維A酸、異維A酸和維生素E的含量。

復方維A酸乳膏；尿囊素；維A酸；異維A酸；維生素E；反相高效液相色譜法

維A酸類藥物被廣泛應用于臨床皮膚科，被稱為皮膚治療學的“第三里程碑”[1]。維A酸乳膏常外用于皮膚疾病的治療，如痤瘡、角化異常性皮膚病、光老化性皮膚病、銀屑病、扁A酸被氧化破壞，提高維A酸的穩(wěn)定性，減少細胞膜脂質和脂蛋白的過氧化，還具有較強的保濕作用，從而與維A酸起協(xié)同作用[5-6]。尿囊素可促進細胞生長，加快傷口愈合，軟化角質蛋白，可用于緩解和治療皮膚干燥癥、鱗屑性皮膚病等，與維A酸和維生素E具有協(xié)同作用[7-8]。近年研制的復方維A酸乳膏（批準文號：遼藥制字LBH00782005），主要成分為維A酸、維生素E和尿囊素[9-10]，為O/W型乳膏。為提高復方維A酸乳膏的療效及穩(wěn)定性，更好地控制其質量，筆者采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法建立了同時測定其中尿囊素、維A酸、異維A酸和維生素E含量的方法。

1 材料

Utimate 3000HPLC儀（美國戴安公司）；SB-5200D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），BS-110S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

復方維A酸乳膏（大連市皮膚病醫(yī)院自制，O/W型，含維A酸、尿囊素、維生素E分別為0.1%、1%、2%，批號：121201、121201-1、121201-2、121201-3）；尿囊素、維A酸、異維A酸和維生素E對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111501-200202、100307-200902、100224-200903、100062-201110）；冰醋酸（分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ODSSyncronis C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水-0.5%冰醋酸，梯度洗脫程序及檢測波長見表1；進樣量：20μl；柱溫：35℃。

表1 流動相梯度洗脫程序及檢測波長Tab 1 Gradient elution process ofmobile phase and detection wavelength

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液的制備 精密稱取尿囊素0.5 g、維生素E 1.0 g，分別置于10m l量瓶中，再精密稱取維A酸0.1 g、異維A酸0.05 g，置于同一10m l量瓶中，分別加入甲醇加熱溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得尿囊素對照品貯備液、維生素E對照品貯備液、維A酸和異維A酸對照品混合貯備液。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密量取尿囊素對照品貯備液2m l、維生素E對照品貯備液2m l、維A酸和異維A酸對照品混合貯備液1m l，置于50m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱取樣品5 g，加甲醇80m l，置于索氏提取器中水浴加熱回流4 h，提取液轉移至100m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 稱取不含維A酸、維生素E、尿囊素的樣品5 g，按“2.2.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，色譜見圖1。結果顯示，尿囊素、異維A酸、維A酸、維生素E保留時間分別是5.38、15.43、17.25、27.79min，分離度均＞1.5，理論板數(shù)均不低于3 000。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.尿囊素；2.異維A酸；3.維A酸；4.維生素EFig 1 HPLC chromatogram sA.substance control；B.teat sample；C.negative control；1.allantoin；2.isomerization A acid；3.vitam in A acid；4.vitam in E

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.2”項下對照品液50、25、12.5、6.25、3.125m l，置于50m l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到系列濃度溶液。按“2.1”項下色譜條件分別吸取20μl進樣，記錄色譜。以各成分峰面積（y）為縱坐標，檢測質量濃度（x，μg/m l）為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程和線性范圍詳見表2。

表2 回歸方程和線性范圍Tab 2 Regression equation and linear range

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2.2”項下對照品溶液20μl，分別按“2.1”項下色譜條件于1 d內(nèi)重復進樣測定5次和連續(xù)測定5 d。結果，尿囊素、維A酸、異維A酸、維生素E的日內(nèi)RSD分別為0.42%、0.59%、0.80%、0.43%，日間RSD分別為0.55%、0.81%、0.40%、0.37%，表明本方法日內(nèi)、日間精密度均良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取樣品（批號：121201）5 g，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，25℃下放置，分別于0、24、48、72、96 h時進樣測定。結果，尿囊素、維A酸、異維A酸、維生素E的RSD分別為0.26%、 0.59%、0.63%、0.52%，表明96 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取樣品（批號：121201）5 g，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，尿囊素、維A酸、異維A酸、維生素E的RSD分別為0.32%、0.59%、0.69%、0.88%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知各成分含量的樣品（批號：121201）6份，每份5 g，分別置于100m l量瓶中，各精密加入“2.2.2”項下對照品溶液25m l，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，按外標法以峰面積計算各成分含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（mg/g，n＝3）Tab 4 Content determ ination of sam p les（mg/g，n＝3）

3 討論

筆者采用RP-HPLC法，不僅同時測定了復方維A酸乳膏中維A酸、尿囊素和維生素E三組分的含量，還測定了降解產(chǎn)物異維A酸的含量。由于維生素E和維A酸為脂溶性成分，尿囊素為水溶性成分，維A酸與異維A酸又互為異構體，因此筆者采用梯度洗脫方式在0～6m in，采用5%甲醇水溶液洗脫尿囊素；在＞6～18m in，采用甲醇-0.5%冰醋酸進行洗脫，減慢流速為1m l/min，使維A酸與異維A酸達基線分離，＞18～30 m in，采用100%純甲醇洗脫維生素E。

為縮短保留時間，筆者曾在流動相中加入異丙醇和四氫呋喃，但發(fā)現(xiàn)保留時間無顯著改變，且加入四氫呋喃后異維A酸與維A酸分離度反而降低，故均未采用。筆者又嘗試提高柱溫，通過對25、30、35、40℃不同柱溫的研究發(fā)現(xiàn)，隨著柱溫的升高，樣品的保留時間逐漸縮短，當柱溫達到40℃時維A酸與異維A酸分離度降低，因此選用35℃柱溫。

在本試驗中，筆者分別對150mm和250mm的色譜柱進行了比較。結果表明，150mm色譜柱保留時間較250mm略有縮短，但是異維A酸與維A酸的分離度在選用250mm色譜柱時顯著優(yōu)于150mm（150mm異維A酸與維A酸的分離度小于1.5），故選用250mm的C18色譜柱，進樣時間30min。

綜上所述，本法操作簡便、快速、準確，適用于同時測定復方維A酸乳膏中尿囊素、維A酸、異維A酸和維生素E的含量。

[1]楊彤.美容藥物學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：69.

[2] 楊帆.自制復方呋爐洗劑與維甲酸霜聯(lián)合治療尋常痤瘡47例[J].皮膚病與性病，2002，24（2）：34.

[3]解小憲，郭秀珍.同時口服和外用維甲酸類藥物治療頑固性扁平疣44例[J].皮膚病與性病，2001，23（3）：22.

[4] 靳培英.維A酸在皮膚病治療中應用的進展[J].中華皮膚科雜志，2000，33（6）：448.

[5] 孫小燕.維生素E的藥理研究和臨床新用[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2010，8（9）：230.

[6] 陸干明，陸文莉.不同基質不同包裝方式維生素E蘆薈霜的保濕性對比分析[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2010，4（21）：13.

[7] 顧文珍，秦萬章.尿囊素的作用及其臨床應用[J].新藥與臨床，1990，9（4）：232.

[8] 尚愛民，徐文閣.復方維A酸霜聯(lián)合維生素C、維生素E治療黃褐斑[J].中華皮膚科雜志，2003，36（12）：727.

[9] 王紅麗，吳鐵，吳志華，等.丹參酮和維生素E抗皮膚衰老作用的比較研究[J].中國老年學雜志，2003，12（23）：861.

[10]黎娟，黃志雄，李清華，等.中藥外洗聯(lián)合地奈德乳膏及維E尿囊素乳膏治療嬰兒濕疹的療效觀察[J].中國臨床新醫(yī)學，2013，6（2）：122.

Simultaneous Determ ination of Allantoin，Tretinion，Isomerization A Acid and Vitam in E in Com pound Tretinion Cream by RP-HPLC

ZHANG Zhi-qin1，LIMei2，ZHU Chang-hui1，WANG Dong1，HAN Guo-zhu2，TANG Ze-yao2（1.Dalian Dermatology Hospital，Liaoning Dalian 116021，China；2.Dept.of Pharmacology，Dalian Medical University，Liaoning Dalian 116044，China）

OBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determ ination of allatoin，tretinion，isomerization A acid and vitam in E in Compound tretinion cream.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determ ination was performed on ODS Syncronis C18column w ith mobile phase consisted of methanol-water-0.5%glacial acetic acid（gradient elution at different flow rates and detection wavelength）；sample size was 20μl and column temperature was 35℃.RESULTS：The linear ranges were 125-2 000μg/m l for allantoin（r＝0.999 8），12.5-200μg/m l for tretinoin（r＝0.999 9），6.25-100μg/m l for isomerization A acid（r＝0.999 8）and 250-4 000μg/m l for vitam in E（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 0.88%.Average recoveries were 99.5%（RSD＝0.24%，n＝6），97.6%（RSD＝0.97%，n＝6），99.8%（RSD＝0.18%，n＝6）and 99.0%（RSD＝0.72%，n＝6）.CONCLUSIONS：Themethod is simple，rapid，accurate and suitable for the content determ ination of allatoin，tretinion，isomerization A acid and vitam in E in Compound tretinion cream.

Compound tretinion cream；A llantoin；Tretinion；Isomerization A acid；Vitam in E；RP-HPLC平疣及皮膚腫瘤等[2-3]。但是，現(xiàn)有市售的維A酸乳膏均為單方制劑，穩(wěn)定性較差，維A酸極易見光異構化降解產(chǎn)生異維A酸，療效并不理想[4]。維生素E為強抗氧化劑，能阻止乳膏中維

R917

A

1001-0408（2014）12-1131-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.26

＊藥師，碩士。研究方向：藥物制劑與質量控制。電話：0411-83781004。E-mail：zhangzhiqin_520666@163.com

2013-10-24

2013-11-26）