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乳腺癌HER-2檢測的概況與進(jìn)展*

2014-02-03 05:41錢曉龍
中國腫瘤臨床 2014年10期
關(guān)鍵詞:原位雜交探針染色體

耿 強(qiáng) 錢曉龍 付 麗

乳腺癌HER-2檢測的概況與進(jìn)展*

耿 強(qiáng) 錢曉龍 付 麗

人類表皮生長因子受體-2(HER-2/neu)是乳腺癌重要的預(yù)后和HER-2靶向藥物治療的預(yù)測指標(biāo),準(zhǔn)確檢測乳腺癌患者的HER-2狀態(tài)對臨床診療具有重要意義。目前美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)和美國病理醫(yī)師學(xué)會(CAP)推薦免疫組織化學(xué)(IHC)、熒光原位雜交(FISH)和亮視野原位雜交(BISH)3種HER-2檢測方法。雖存在各自的優(yōu)勢和不足,但在少數(shù)情況下仍無法檢測部分患者HER-2的狀態(tài)。銀增強(qiáng)原位雜交(SISH)、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Q-RT-PCR)和RNA原位雜交(RNA-ISH)等新的檢測方法也不斷應(yīng)用到HER-2檢測中,因其自身的獨(dú)特優(yōu)勢,滿足了部分患者的HER-2檢測需求,因而有很好的臨床應(yīng)用前景。本文將對這些技術(shù)的特點(diǎn)及其優(yōu)勢和存在的不足進(jìn)行綜述。

人類表皮生長因子受體-2 HER-2/neu檢測 乳腺癌

人類表皮生長因子受體-2(HER-2/neu)基因是定位于染色體17q12~21上的原癌基因,在20%~30%被確診的乳腺癌患者中存在HER-2基因擴(kuò)增或蛋白過表達(dá)情況[1]。HER-2陽性的乳腺癌患者往往表現(xiàn)為腫瘤惡性程度高、治療效果及預(yù)后較差,但其對使用特異的HER-2靶向藥物治療效果較好。因此,準(zhǔn)確地檢測乳腺癌患者的HER-2狀態(tài)對于臨床進(jìn)行個體化治療和評估預(yù)后至關(guān)重要[2]。近年,乳腺癌組織中HER-2狀態(tài)檢測的應(yīng)用技術(shù)越來越多。大致分為:1)HER-2蛋白水平的檢測,如免疫組織化學(xué)(IHC);2)HER-2基因DNA水平的檢測,如熒光原位雜交(FISH)、亮視野原位雜交(BISH)、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)等;3)HER-2轉(zhuǎn)錄水平的檢測,如定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Q-RT-PCR)、RNA原位雜交(RNA-ISH)等。本文將對這些技術(shù)的特點(diǎn)進(jìn)行介紹,并對其優(yōu)勢和存在的不足進(jìn)行綜述。

1 乳腺癌HER-2檢測的現(xiàn)狀

目前國內(nèi)外乳腺癌HER-2檢測最常用的方法為IHC和FISH[3]。IHC是一項廣泛而實用的技術(shù),具有檢測成本低、操作簡單、耗時短、可實現(xiàn)自動化檢測和染色后切片便于存檔等優(yōu)點(diǎn),閱片時可同時進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)評價,已成為乳腺癌患者檢測HER-2擴(kuò)增初篩最常使用的方法[3]。FISH較IHC更特異、更準(zhǔn)確并且穩(wěn)定性更高,尤其是雙探針FISH在原來單一的HER-2探針的基礎(chǔ)上加入了17號染色體著絲粒探針(CEP17)作為內(nèi)對照,已成為目前HER-2檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。

IHC是一種半定量的方法,易受到受檢組織固定時間、固定液的選擇、抗體試劑盒的選擇和染色結(jié)果判讀的主觀性等諸多因素的影響[5],因此準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性差于FISH。但FISH作為一門專業(yè)技術(shù),其操作步驟和設(shè)備遠(yuǎn)比IHC更復(fù)雜,而且還有信號判讀時缺乏組織形態(tài)學(xué)參考及染色后的切片不宜長時間保存等不足[6-7]。另外FISH的準(zhǔn)確性還受17號染色體異倍體及腫瘤異質(zhì)性等因素的影響[3,8],亦存在少數(shù)病例因標(biāo)本較少或前期處理不當(dāng)而無法進(jìn)行FISH檢測或多次檢測結(jié)果均為臨界值,無助于臨床治療。對于FISH無法確定HER-2狀態(tài)的標(biāo)本應(yīng)積極選擇其他方法(如PCR、RNA-ISH等)進(jìn)行檢測。

2 乳腺癌HER-2檢測的新進(jìn)展

2.1 BISH

BISH是近十幾年來出現(xiàn)的HER-2基因檢測的新技術(shù),主要包括顯色原位雜交技術(shù)(CISH)、銀增強(qiáng)原位雜交(SISH)等方法。2013年10月ASCO/CAP發(fā)布了乳腺癌HER-2檢測指南,將BISH列為乳腺癌HER-2檢測的新技術(shù)[1]。

2.1.1 CISH CISH由Tanner等[9]用來首先報道檢測HER-2基因擴(kuò)增,主要原理是使用地高辛或生物素標(biāo)記的探針在癌組織切片上進(jìn)行雜交反應(yīng),顯色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察HER-2信號的方法。

CISH是一種定量的HER-2檢測方法,與IHC相比CISH特異性更強(qiáng)、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性更高[7]。CISH與FISH相比,CISH獨(dú)特的優(yōu)勢在于可以在普通光學(xué)顯微鏡下觀察HER-2基因信號,并能同時進(jìn)行組織學(xué)評價,另外CISH操作步驟和設(shè)備較簡單,染色后的切片信號穩(wěn)定,便于長期存檔[6]。CISH分為單、雙探針CISH。單探針CISH僅含有HER-2基因探針,信號單一且空間分辨率較低,可能會造成HER-2基因低度擴(kuò)增病例被漏診,當(dāng)HER-2基因低度擴(kuò)增的信號數(shù)與無擴(kuò)增的信號數(shù)相接近時,亦容易造成誤判。另外,單探針CISH缺乏CEP17作為內(nèi)對照,無法排除單色探針可能造成的假陰性(17號染色體單體)或假陽性(17號染色體多體)。雙探針CISH在HER-2探針(綠色信號)的基礎(chǔ)上加入CEP17號探針(紅色信號)作為內(nèi)對照,通過計算綠/紅色信號的比值來表示HER-2基因狀態(tài),從而很好的解決了上述的問題[10]。單、雙探針CISH的評分標(biāo)準(zhǔn)均可參照ASCO/CAP指南中原位雜交(ISH)的標(biāo)準(zhǔn),Jacquemier等[11]通過分析多中心的乳腺癌HER-2檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)CISH和FISH總一致性為98%。因此CISH適合在無FISH檢測條件的實驗室使用[12]。

2.1.2 SISH SISH用于HER-2基因擴(kuò)增檢測,主要是利用酶促反應(yīng)原理促進(jìn)銀離子沉積并凝固到HER-2基因的靶位點(diǎn)而產(chǎn)生精確的顯色信號,對顯色信號分析后獲得HER-2基因狀態(tài)的方法[10]。雖與CISH有一些共同優(yōu)點(diǎn),如SISH可在普通光學(xué)顯微鏡下判讀HER-2基因信號、同時可進(jìn)行組織學(xué)評價、染色后的切片信號穩(wěn)定亦便于長期保存等,但較CISH準(zhǔn)確度更高、耗時更少[7,13]。SISH與FISH相比較,操作步驟簡單易掌握,可實現(xiàn)全程自動化檢測,6 h內(nèi)可獲得檢測結(jié)果[6],符合臨床快速診斷的要求。并且評分標(biāo)準(zhǔn)完全可以參照ASCO/CAP的評分標(biāo)準(zhǔn)[14]。SISH分為單、雙探針SISH。單探針SISH的缺點(diǎn)類似于單探針CISH,雙探針SISH引入CEP17探針作內(nèi)對照,已被FDA批準(zhǔn)用于HER-2檢測。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道,SISH檢測HER-2基因狀態(tài)與FISH的符合率達(dá)87%~97%[14-15]。因此SISH可能在未來成為乳腺癌HER-2檢測的常規(guī)方法。當(dāng)然作為一種新技術(shù)SISH也有一些不足,如檢測成本較高、銀染的HER-2基因信號為黑色而內(nèi)對照CEP17信號是紅色造成信號對比不夠清晰[10]。

2.2 MLPA

MLPA的檢測原理主要為使用熒光標(biāo)記的探針與HER-2基因的DNA進(jìn)行雜交,之后通過連接、PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集,對收集的數(shù)據(jù)使用軟件進(jìn)行分析后得出檢測結(jié)果。該技術(shù)操作簡單并可實現(xiàn)自動化檢測,還具有檢測成本低廉、耗時短、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[6,16-17]。特別適合用來檢測片段化的DNA樣本,如中性福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的腫瘤組織,并且少量標(biāo)本便可實現(xiàn)檢測目的。在HER-2基因檢測的同時,MLPA可對17號染色體上不同區(qū)域的多個靶基因進(jìn)行檢測,有利于17號染色體非整倍體的檢測并獲得不同區(qū)域的靶基因異常擴(kuò)增信息[7]。但是該技術(shù)也存在一些缺點(diǎn),如檢測標(biāo)本缺乏組織形態(tài)學(xué)的評價、DNA提取中難免混有非浸潤性癌組織的DNA、可能受到靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染等。Moelans等[16]發(fā)現(xiàn)MLPA和FISH/CISH有很好的一致性,是一種可靠的HER-2檢測方法。因此對于組織較少無法進(jìn)行FISH/CISH檢測或需同時檢測17號染色體上多個基因的乳腺癌病例可選擇MLPA進(jìn)行檢測。

2.3 Q-RT-PCR

Q-RT-PCR在HER-2基因檢測的原理是將HER-2基因信使核糖核酸(mRNA)逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)再進(jìn)行實時PCR反應(yīng),通過測定樣品中特定mRNA含量,繼而反映細(xì)胞內(nèi)HER-2基因表達(dá)量[18]。該方法具有PCR的普遍優(yōu)點(diǎn),如檢測成本低廉、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單和自動化檢測等[19],尤其適合對新鮮的冰凍組織進(jìn)行檢測,并且少量組織便可獲得檢測結(jié)果。但是該技術(shù)最大的缺點(diǎn)是在DNA/RNA提取過程中不可避免的混入非浸潤癌成分,也不能徹底消除腫瘤異質(zhì)性和17號染色體異倍體對檢測結(jié)果的影響,另外因組織固定等原因?qū)е翲ER-2基因mRNA片段降解和操作中RNA酶的污染,也可能干擾檢測結(jié)果,造成檢測結(jié)果的不穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)Q-RT-PCR檢測HER-2擴(kuò)增和IHC一致率可達(dá)97%[20],但也有研究表明相比于IHC/FISH,Q-RT-PCR更易造成HER-2的假陰性[21]??梢奞-RT-PCR進(jìn)行HER-2檢測還存在爭議。Q-RT-PCR因較少的標(biāo)本便能進(jìn)行HER-2基因的高通量檢測,對乳腺癌的治療及預(yù)后可能有較好的應(yīng)用前景。

2.4 RNA-ISH

RNA-ISH進(jìn)行HER-2檢測的原理與DNA-ISH類似,通過使用地高辛或熒光素標(biāo)記的探針與被檢組織中HER-2基因的mRNA片段進(jìn)行雜交反應(yīng),然后進(jìn)行顯色或激發(fā)光照射,在普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下對mRNA信號進(jìn)行定量,繼而獲得被檢組織HER-2基因表達(dá)情況。RNA-ISH是一種特異而敏感的檢測方法,可對新鮮的冰凍組織或FFPE組織進(jìn)行快速檢測,檢測需要標(biāo)本量較少并且全程自動化檢測[22]。但是作為一種新技術(shù),RNA-ISH也有一些不足,如檢測標(biāo)本mRNA可能降解、操作過程中可能受到RNA酶的污染、判讀結(jié)果時缺乏組織形態(tài)學(xué)資料等。西班牙Alba等[23]發(fā)現(xiàn)RNA-ISH與FISH和IHC的一致性分別為96.5%和95.2%。所以RNA-ISH也可能是檢測HER-2狀態(tài)的一種比較可靠方法。

3 結(jié)語

綜上所述,準(zhǔn)確檢測乳腺癌患者HER-2的狀態(tài)是乳腺癌患者預(yù)后評估和制定有效治療方案的先決條件,對乳腺癌的診療具有重要的指導(dǎo)作用。隨著研究的深入,HER-2檢測技術(shù)也處于不斷發(fā)展中。目前IHC、FISH、CISH等常規(guī)的HER-2檢測技術(shù)因自身的不足和17號染色體異倍體等局限性而無法滿足一些患者HER-2的檢測需求。因此不斷發(fā)展和評估新的實用技術(shù),如SISH、MLPA、Q-RT-RCR和RNA-ISH等彌補(bǔ)傳統(tǒng)技術(shù)的不足,為臨床診療工作提供參考,對乳腺癌患者更好地進(jìn)行個體化治療具有重要意義。

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(2014-03-08收稿)

(2014-04-16修回)

Current situation and development of HER-2 testing in breast cancer

Li FU;E-mail:fulijyb@hotmail.com
Department of Breast Cancer Pathology and Research Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China

Human epidermal growth factor receptor 2(HER-2/neu)is an important prognostic predictor and the key predictor of anti-HER-2 therapy of breast cancer.Accurate testing of HER-2 status for breast cancer patients is important in clinical practice.As of this writing,the American Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologists recommend three methods for HER-2 detection,namely,immunohistochemistry,fluorescence in situ hybridization,and bright-field in situ hybridization.The abovementioned methods have their own advantages and disadvantages.New methods,such as multiplex ligation-dependent probe amplification,quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,and RNA in situ hybridization,are currently applied to detect HER-2 status.New technologies not only make up for the shortcomings of routine methods but also have unique benefits that can meet the demands for HER-2 testing of some breast cancer patients.Thus,these methods are promising for clinical applications and can improve clinical diagnosis and treatment.The characteristics,advantages,and drawbacks of these technologies are introduced and reviewed in this paper.

HER-2,HER-2/neu testing,breast cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.20140377

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室,國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津市腫瘤防治重點(diǎn)實驗室(天津市300060)

*本文課題受國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目(編號:30930038)資助

付麗 fulijyb@hotmail.com

Qiang GENG,Xiaolong QIAN,Li FU

This study was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China(No.30930038)

張亻 刡)

耿強(qiáng) 碩士研究生。研究方向為乳腺癌生長侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制。

E-mail:jedgeng@163.com

·特約綜述·

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