任 爽 秦艷茹 張 巖 賈永旭 趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

順鉑(DDP)是肺癌化療常用的藥物之一，通過(guò)干擾DNA復(fù)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡，但癌細(xì)胞容易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性。因此，如何增加癌細(xì)胞對(duì)其敏感性是困擾臨床亟需解決的問(wèn)題。相關(guān)研究認(rèn)為自噬是化療藥物作用機(jī)制之一，可能在耐藥性中發(fā)揮一定作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)沉默自噬相關(guān)基因Beclin 1，探討其對(duì)人肺癌A549細(xì)胞DDP耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌A549細(xì)胞株由河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室凍存。Psilencer3.1質(zhì)粒為鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室保存。RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。梭華-Sofast基因轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Calbiochem公司。T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Beclin 1、β-actin單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)于Sigma公司。DDP購(gòu)于山東齊魯制藥有限公司。

1.2Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)GenBank(NM_003766)Beclin 1基因mRNA的已知序列，選擇2個(gè)靶位點(diǎn)(285-304、676-695)，每條模板鏈的組成包括19個(gè)堿基正義鏈和與其互補(bǔ)的19個(gè)堿基的反義鏈，正反鏈之間有9個(gè)堿基(TTCAAGAGA)間隔，反義鏈之后有5個(gè)T作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，在模板鏈的兩端加入Bam HI及Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。兩條鏈在退火緩沖液〔100 mmol/L K-acetate，30 mmol/L Hepes-KOH，(pH7.4)，2 mmol/L Mg-acetate〕作用下退火(90℃ 3 min，37℃ 1 h)，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，在T4 DNA連接酶作用下連接于線(xiàn)性化的Psilencer 3.1質(zhì)粒上，Psilencer 3.1-siRNA-Beclin 1重組質(zhì)粒通過(guò)測(cè)序，RT-PCR及Western印跡方法鑒定。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。A549/DDP細(xì)胞的培養(yǎng)條件同前，但每隔兩代培養(yǎng)液中加入終濃度5 μmol/L的DDP以維持耐藥性。

1.4細(xì)胞篩選、轉(zhuǎn)染與分組 轉(zhuǎn)染前24 h，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549/DDP細(xì)胞按1.5×105個(gè)/孔接種于24孔板，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)。次日待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞(C組)，以空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(B組)和未轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞(A組)為對(duì)照。

1.5RT-PCR方法檢測(cè)Beclin 1 mRNA的表達(dá) 收集A、B、C組細(xì)胞，總RNA提取按Invitrogen公司Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以DNA/RNA測(cè)定儀測(cè)定RNA的純度和濃度。按逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說(shuō)明合成cDNA待用。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照，目的片段為452 bp，引物序列為:上游：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。Beclin 1序列為：上游：5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3′，下游：5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3′，目的片段為363 bp。PCR條件：94℃ 1 min。55℃ 1.5 min。72℃ 0.5 min，共30個(gè)循環(huán)。結(jié)果用Quality One分析，以陽(yáng)性條帶與GAPDH光密度比值作為陽(yáng)性條帶的相對(duì)表達(dá)值。

1.6Western印跡檢測(cè)Beclin 1 蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用RIPA buffer 200 μl裂解細(xì)胞，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)印和封閉后，分別加Beclinl抗體(1∶1 000) 4℃孵育過(guò)夜，堿性磷酸酶標(biāo)記二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，堿性磷酸酶染色5 min，膠片曝光顯影，結(jié)果用Quality One分析。用β-actin為內(nèi)對(duì)照，以陽(yáng)性條帶與內(nèi)對(duì)照光密度比值作為陽(yáng)性條帶的相對(duì)表達(dá)值。

1.7MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性 將各組細(xì)胞按2×103個(gè)/孔接種于96孔板，24 h后加入終濃度為0、10、20、30、40、50、60、80、100、120 μmol/L的DDP，每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育3 h后更換成完全培養(yǎng)基。72 h恢復(fù)期后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，作用4 h后棄去上清液，酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞存活率，方法為各濃度組A值/未加藥組A值×100%，以Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.8MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，胰酶消化后按2×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，共接種5板。每間隔1 d取出1板，MTT法測(cè)定A值。

1.9流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 胰酶消化各組細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個(gè)/ml，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入annexin V-APC 5 μl和PI溶液10 μl，室溫避光孵育15 min，LSRII流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickinson公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Cell Quest軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后A549/DDP細(xì)胞中Beclin 1基因的表達(dá)情況 以A組Beclin 1基因的表達(dá)水平為100%，C組細(xì)胞中Beclin 1 mRNA的表達(dá)水平下降(80±5)%，Beclin 1蛋白的表達(dá)水平下降(74±5)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；B組細(xì)胞中Beclin 1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平是A組的(102±4)%和(96±7)%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染后A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性及增殖情況 與A、B組細(xì)胞相比，C組與DDP孵育后的細(xì)胞存活率明顯降低；C組細(xì)胞對(duì)DDP的IC50為(18±3)μmol/L，與A組細(xì)胞〔(40±12)μmol/L〕、B組細(xì)胞〔(42±9)μmol/L〕比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組細(xì)胞與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3檢測(cè)后三組細(xì)胞凋亡率情況 流式細(xì)胞儀檢測(cè)C組細(xì)胞凋亡率為(9.5±1.1)%，與B組細(xì)胞〔(4.0±1.5)%〕、A組細(xì)胞〔(3.9±1.3)%〕比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

3 討 論

Beclin 1是參與自噬的特異性基因，位于人類(lèi)染色體17q21上，大約有150 ku。Beclin 1通過(guò)調(diào)節(jié)自噬水平參與細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的循環(huán)及再利用、受損細(xì)胞器的清除，并維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。DDP是用于肺癌的一線(xiàn)化療藥物，可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程，并損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，但其腫瘤耐藥性一直是臨床治療難以克服的障礙〔2〕。有研究〔3〕表明DDP等藥物可引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，說(shuō)明自噬可能與腫瘤耐藥性存在一定的關(guān)系。本研究結(jié)果提示Beclin 1基因沉默能一定程度地恢復(fù)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，表明Beclin 1基因在肺癌DDP耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可能是Beclin 1基因參加肺癌DDP耐藥的機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，靶向Beclin 1基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖能力下降，可能與Beclin 1基因參與細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)。提示Beclin 1基因在腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)RNA干擾下調(diào)Beclin 1基因表達(dá)，能抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖信號(hào)傳導(dǎo)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，使細(xì)胞增殖能力下降。

綜上，以Beclin 1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的RNA干擾技術(shù)可有效恢復(fù)A549/DDP細(xì)胞的化療敏感性，抑制細(xì)胞的增殖能力，針對(duì)Beclin 1的基因治療可能逆轉(zhuǎn)肺癌DDP耐藥。

4 參考文獻(xiàn)

1Rosenfeldt MT, Ryan KM.The role of autophagy in tumour development and cancer therapy〔J〕. Expert Rev Mol Med,2009;11:e36.

2潘麗紅, 趙 松, 黨麗峰, 等. 自噬在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞死亡中的作用〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2013;30(11): 2339-41.

3劉東雷, 王建軍, 楊 洋, 等.自噬在順鉑誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞死亡中的作用〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2010;27(9):1198-9.