王伯玉 陸 斌 羅毅男 葛鵬飛 周 暢

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

缺血后再灌注造成的腦損傷已經(jīng)成為影響閉塞血管-血管再生預(yù)后的重要因素〔1〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，局灶性缺血和再灌注造成腦損傷的病理因素很多，如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白質(zhì)聚集〔2,3〕。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)是決定腦缺血后果的關(guān)鍵因素，抑制神經(jīng)炎癥因子已經(jīng)成為保護(hù)腦損傷的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 成年雄性大鼠(n=45; 體重280～300 g; 7～8周齡，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)溫度控制在22℃～25℃，12 h的光/暗周期處理，自由進(jìn)食進(jìn)水。所有動(dòng)物操作獲得吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)原則，盡可能減少在本研究中動(dòng)物所遭受的痛苦和用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)量〔4〕。

1.2缺血后處理方案 將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、局灶性缺血組和缺血后處理組(每組15只)。局灶性缺血組和缺血后處理組的大鼠按照描述進(jìn)行2 h的局灶性腦缺血處理，局灶性缺血組大鼠不進(jìn)行進(jìn)一步的再灌注中斷處理。缺血后處理組大鼠接受2 h的局灶性缺血處理后，進(jìn)行3次30 s/30 s的再灌注/再阻塞處理。假手術(shù)組大鼠接受除大腦中動(dòng)脈閉塞外的其他相同操作。

1.3梗死體積測(cè)量 再灌注24 h后，由操作人員(研究外人員)在每組中隨機(jī)選出5只大鼠，用過(guò)量的戊巴比妥注射處死大鼠，快速剝離大腦。梗死體積的測(cè)量需借助TTC染色 (TTC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)。將大腦切成2 mm厚的冠狀切片，4%多聚甲醛過(guò)夜浸泡，用1%TTC溶液37℃染色30 min。用動(dòng)物全腦組織測(cè)量大腦梗死的比例〔5〕。

1.4神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)估 大腦中動(dòng)脈閉塞24 h后，按照下列評(píng)分系統(tǒng)對(duì)所有小組進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)估，分為0 分(沒(méi)有明顯病態(tài))、1分(尾巴止停時(shí)側(cè)前肢彎曲)、2分(牽拉尾巴時(shí)側(cè)前肢抓地力降低)、3分(多方向自發(fā)活動(dòng);只有在牽拉尾巴時(shí)發(fā)生側(cè)向盤旋)、4分(自發(fā)側(cè)向盤旋)、5分(麻醉復(fù)蘇后死亡) 。每組5只大鼠。

1.5檢測(cè)指標(biāo) 局灶性缺血處理24 h后，剝離大腦，RT-PCR 測(cè)定TNF-α和IL-1β mRNA 表達(dá)量。用特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Thermo Scientific Company, Rockford, IL, USA)測(cè)量IL-1β和TNF-α蛋白濃度。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均重復(fù)4次，每次3個(gè)重復(fù)。

1.6蛋白質(zhì)免疫印跡 將缺血半影區(qū)皮質(zhì)組織均勻分布到冰冷的緩沖液中，勻漿離心(10 000r/min，20 min，4℃)，并測(cè)量上清液中的蛋白質(zhì)濃度。

用12% SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組有四個(gè)樣本(來(lái)自不同大鼠)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜上有抗-TLR2 (1∶1 000,Abcam, Cambridge, MA, USA)的探針。室溫下，將膜用抗兔二抗(1∶50 000)孵育1 h。ECL檢測(cè)顯影，用Kodak 1D凝膠分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶的光密度進(jìn)行定量。假手術(shù)組的光密度值作為基線參考值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組的比值作為變化值。

2 結(jié) 果

大腦中動(dòng)脈閉塞所造成的腦缺血成功誘導(dǎo)局灶性缺血組和缺血后處理組中所有大鼠的梗死。與局灶性缺血組相比，缺血后處理組的梗死體積和神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分均顯著降低(P<0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，局灶性缺血組神經(jīng)炎癥因子TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高(P<0.01)。然而，缺血后處理可以顯著消除這種效應(yīng)(P<0.01)。ELISA結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，局灶性缺血組神經(jīng)炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平也均顯著升高(P<0.01)。缺血后處理會(huì)抑制由缺血/再灌注造成的TNF-α和IL-1β表達(dá)增加(P< 0.01)。 蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示：缺血后處理會(huì)顯著限制TLR2(促神經(jīng)炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的上游調(diào)控因子)的表達(dá)。

3 討 論

目前的研究表明，3次30 s的再灌注/再阻塞是一種有效的缺血后處理方法，它會(huì)降低腦梗死體積并改善神經(jīng)系統(tǒng)功能。此外，缺血后處理會(huì)抑制由局灶性缺血/再灌注造成促炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平提高。同時(shí)，缺血后處理也會(huì)降低TLR2的表達(dá)水平。

腦損傷是造成缺血/再灌注后神經(jīng)系統(tǒng)障礙的主要因素之一〔6〕。另一方面，減少腦梗死對(duì)局灶性缺血/再灌注處理大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能有益。這些報(bào)道表明，對(duì)受傷腦組織的保護(hù)有助于改善神經(jīng)系統(tǒng)功能。盡管已經(jīng)提出了氧化應(yīng)激和鈣離子超載這些理論來(lái)解釋缺血/再灌注后的腦損傷，但是目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)是造成腦損傷的關(guān)鍵因素之一〔7〕。在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，缺血后處理可以改善經(jīng)局灶性缺血/再灌注處理過(guò)大鼠的神經(jīng)機(jī)能障礙，并會(huì)降低腦梗死的體積。這表明缺血后處理所造成神經(jīng)系統(tǒng)功能的改善與損傷腦組織的減少有關(guān)。

盡管沒(méi)有直接的研究表明細(xì)胞因子 IL-1β和TNF-α是TLR2的調(diào)控靶點(diǎn)，但是先前研究表明TLR2也參與由大腦缺血/再灌注所造成的炎癥反應(yīng)。在本研究中，缺血后處理會(huì)降低損傷腦組織中的TLR2水平，這可能有助于缺血后處理對(duì)腦損傷的保護(hù)作用。

總之，缺血后處理會(huì)顯著降低由局灶性缺血/再灌注造成的腦梗死體積并改善其神經(jīng)機(jī)能障礙。缺血后處理的保護(hù)作用與TLR2, TNF-α和IL-1β的抑制顯著相關(guān)。同時(shí)，抗炎癥作用可以作為預(yù)防由缺血/再灌注所造成腦損傷的新研究靶點(diǎn)。

4 參考文獻(xiàn)

1Tjoumakaris SI, Jabbour PM, Rosenwasser RH.Neuroendovascular management of acute ischaemic stroke〔J〕. Neurosurg Clin N Am, 2009; 20:419- 29.

2Buch P, Patel V, Ranpariya V,etal. Neuroprotective activity of Cymbopogon martinii against cerebral ischemia/reperfusion-induced oxidative stress in rats〔J〕. J Ethnopharmacol, 2012;142:35-40.

3Osada N, Kosuge Y, Ishige K,etal. Characterization of neuronal and astroglial responses to ER stress in the hippocampal CA1 area in mice following transient forebrain ischemia〔J〕.Neurochem Int, 2010;57:1-7.

4National research council(US) committee for the update of the guide for care and use of laboratory animals.Guide for the care and use of laboratory animals〔M〕. 8th edn. Washington (DC): National Academies Press (USA), 2011:32-5.

5Li ZY, Liu B, Yu J,etal. Ischaemic postconditioning rescues brain injury caused by focal ischaemia/reperfusion via attenuation of protein oxidization〔J〕. J Int Med Res, 2012;40:954-66.

6Guo RB, Wang GF, Zhao AP,etal. Paeoniflorin protects against ischemia-induced brain damages in rats via inhibiting MAPKs/NF-κB-mediated inflammatory responses〔J〕. PLoS One, 2012;7:e49701.

7Wang Y, Ge P, Zhu Y. TLR2 and TLR4 in the brain injury caused by cerebral ischemia and reperfusion〔J〕. Mediators Inflamm 2013;2013:124614. doi: 10.1155/2013/124614.