王 曼，莊朋偉，周會(huì)芳，王詩羽，崔廣智，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

藥物引起的過敏／類過敏反應(yīng)是臨床常見的不良反應(yīng)之一。傳統(tǒng)的過敏／類過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)方法多選用豚鼠，通過考察給藥后豚鼠出現(xiàn)的噴嚏、抓鼻、呼吸困難、抽搐昏倒或死亡等現(xiàn)象，以判斷藥物是否可以引起過敏／類過敏反應(yīng)［1］，存在實(shí)驗(yàn)周期性長、靈敏度低、誤差大等缺點(diǎn)。大量研究表明［2］，藥物作用于肥大細(xì)胞，激活并釋放活性介質(zhì)是引發(fā)過敏／類過敏反應(yīng)的直接原因。因此，體外檢測(cè)肥大細(xì)胞脫顆粒可以反映藥物是否可以引起過敏／類過敏反應(yīng)。

嗜堿性白血病細(xì)胞（RBL-2H3）具有肥大細(xì)胞的許多生物學(xué)特性，RBL-2H3被認(rèn)為是體外檢測(cè)脫顆粒反應(yīng)的最佳模型［3］。

傳統(tǒng)脫顆粒檢測(cè)方法多需輔助外界染色劑或標(biāo)記物來檢測(cè)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的物質(zhì)［4－6］，且很難在活細(xì)胞的狀態(tài)下觀察脫顆?，F(xiàn)象。細(xì)胞脫顆粒時(shí)伴隨細(xì)胞形態(tài)的改變，xCELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)（real-time cell electronic sensing，RT-CES），可以檢測(cè)到電極板中細(xì)胞形態(tài)的變化，以細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）的形式顯示［7］。本研究利用 RTCES系統(tǒng)，實(shí)時(shí)、快速、敏感的監(jiān)測(cè)細(xì)胞發(fā)生脫顆粒的過程，初步建立了一種新的肥大細(xì)胞脫顆粒體外檢測(cè)技術(shù)，為體外類過敏反應(yīng)快速評(píng)價(jià)提供了一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 RBL-2H3，購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，DMEM常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國，批號(hào)：8112118），胎牛血清（天津市中奧天原生物制品有限公司），0.25%胰酶（吉諾生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：07121103），Compound 48／80（Sigma，美國，批號(hào)：1002340712），甲苯胺藍(lán)（Sigma，美國，批號(hào)：1002341392），5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific Cytoperm公司），倒置相差顯微鏡（德國XD-101 98010），E-Plate 16電極板、xCELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)（RT－CES，美國艾森公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) RBL-2H3細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含15%胎牛血清），培養(yǎng)于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中。RBL-2H3細(xì)胞為貼壁生長，當(dāng)細(xì)胞生長鋪滿約80%培養(yǎng)瓶底面積時(shí)，可進(jìn)行傳代。傳代比例為1∶3，4 d傳代1次。

1．3 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同濃度Compound 48／80對(duì)RBL-2H3的影響 選擇合適密度的RBL-2H3細(xì)胞，接種于E-Plate 16電極板，每孔100μl，監(jiān)測(cè)24 h，待細(xì)胞增長穩(wěn)定后，加入不同濃度 Compound 48／80，使終濃度達(dá)分別為 2.5、5、10、20、40、80 mg·L－1，并設(shè)置空白對(duì)照，每次監(jiān)測(cè)間隔時(shí)間為5 min，監(jiān)測(cè)48 h，檢測(cè)CI值變化。

1.4 甲苯胺藍(lán)染色 選擇適宜密度的RBL-2H3細(xì)胞，接種于12孔板培養(yǎng)，待24 h細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度Compound 48／80（5、10、20 mg·L－1），空白組加入等體積培養(yǎng)基，于37℃孵育1 h后，每孔加入0.5%的甲苯胺藍(lán)染液進(jìn)行染色，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞脫顆粒形態(tài)的變化。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度Compound 48／80對(duì)肥大細(xì)胞的影響 以合適的細(xì)胞密度接種于電極板中，穩(wěn)定培養(yǎng)24 h，加入不同濃度Compound 48／80，RT-CES實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)24 h。與空白對(duì)照組比較，Compound 48／80濃度為 20 mg·L－1時(shí) Compound 48／80有明顯改變肥大細(xì)胞正常增長規(guī)律，CI值在加藥后30 min內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，30 min～60 min CI值轉(zhuǎn)為上升，60 min后又下降。結(jié)果提示，20 mg·L－1Compound 48／80引起的肥大細(xì)胞脫顆粒、變形，在RT-CES實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)中表現(xiàn)出了特異性變化。濃度低于5 mg·L－1時(shí)對(duì)肥大細(xì)胞的生長曲線無明顯影響；濃度高于40 mg·L－1時(shí)CI值明顯下降，至48 h接近0點(diǎn)，說明此濃度明顯抑制RBL-2H3生長。

2.2 甲苯胺藍(lán)染色 甲苯胺藍(lán)染色可檢測(cè)肥大細(xì)胞脫顆粒的形態(tài)變化，為驗(yàn)證Compound 48／80引起RBL-2H3細(xì)胞在RT-CES系統(tǒng)中特征性曲線變化與脫顆粒的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)基于RT-CES系統(tǒng)曲線特異性變化，利用甲苯胺藍(lán)染色方法，考察了 Compound 48／80不同濃度（5、10、20 mg·L－1）和不同作用時(shí)間（5、30、60 min）對(duì)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的影響?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞生長良好，呈梭形或多形性，細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞質(zhì)飽滿，染成深藍(lán)色；Compound 48／80濃度為5 mg·L－1組細(xì)胞狀態(tài)與空白對(duì)照組類似，無明顯變化；10 mg·L－1組細(xì)胞梭形逐漸變圓，細(xì)胞膜外有散在的顆粒；20 mg·L－1組的細(xì)胞梭形基本消失，細(xì)胞變圓或成蝌蚪狀，細(xì)胞膜外有大量明顯的顆粒。結(jié)果提示，RT-CES系統(tǒng)曲線特異性變化與RBL-2H3細(xì)胞變形、脫顆粒密切相關(guān)，RT-CES系統(tǒng)特異性曲線可以在一定程度上反映細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象。

3 討論

本研究采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)，基于細(xì)胞形態(tài)的變化，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)藥物引起的細(xì)胞狀態(tài)的改變。通過實(shí)時(shí)檢測(cè)傳感器表面的電阻抗信號(hào)，以CI值來反映細(xì)胞生長狀態(tài)，其中包括細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞黏附、細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)變化［8－9］。

Compound 48／80是引起肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)的的工具藥［10］，運(yùn)用RT-CES系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)不同濃度Compound 48／80引起RBL-2H3脫顆粒的變化，可發(fā)現(xiàn)60 min內(nèi)，不同濃度的CI值曲線都有變化，以20 mg·L－1組的變化最明顯，這是細(xì)胞脫顆粒及形態(tài)變化產(chǎn)生的，在甲苯胺藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。此方法實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)、敏感監(jiān)測(cè)肥大細(xì)胞脫顆粒且不損傷細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)初步探討了基于RT-CES系統(tǒng)的體外肥大細(xì)胞脫顆粒檢測(cè)方法。RT-CES特異性曲線變化可以在一定程度反映肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象。但由于此方法的初步建立，尚未考察肥大細(xì)胞脫顆粒具體量化標(biāo)準(zhǔn)，如CI值在哪個(gè)具體數(shù)值時(shí)肥大細(xì)胞開始發(fā)生脫顆粒，CI值的變化與炎性介質(zhì)釋放的關(guān)系等問題，均有待進(jìn)一步深入研究。

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