范曉迪，劉建勛，林成仁

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗研究中心，北京 100091）

腦卒中（stroke）是由于急性腦循環(huán)障礙所致的局限或全面性腦功能缺損綜合征，是目前導(dǎo)致人類死亡與殘疾的三大主要疾病之一。腦卒中包括缺血性和出血性兩大類，其中缺血性腦卒中（ischemic stroke），又稱腦梗死（cerebral infarct），是腦血管疾?。╟erebrovascular disease，CVD）的最常見類型，可占70%。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是誘發(fā)心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)外關(guān)于動脈粥樣硬化腦缺血／再灌注模型研究的報道較少，一般多采用大鼠制備腦缺血模型，其主要原因在于大鼠腦血管解剖結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元接近高等動物，重現(xiàn)性好且廉價，但單因素模型未能較確切地模擬人類在動脈病變致慢性缺血性損害基礎(chǔ)上發(fā)生的急性腦卒中。為了系統(tǒng)地研究腦缺血的病理生理及觀察藥物的治療作用，必須有一個較接近臨床的，重現(xiàn)性好，可控的腦缺血動物模型。由于動脈粥樣硬化腦缺血／再灌注模型更加符合人類的病理生理過程，因此現(xiàn)將國內(nèi)外關(guān)于此類報道綜述如下。

1 實驗動物的選擇

制備AS動物模型常用的動物有兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、鵪鶉、狗、豬和非人類靈長類動物等，每種動物都有其各自的優(yōu)缺點，依據(jù)實驗的研究目的不同可以選擇適合的動物建立模型。近些年，國外制備AS動物模型主要應(yīng)用基因敲除小鼠（ApoE KO／LDLr KO）；國內(nèi)主要以兔和大鼠研究居多。對于制備腦缺血模型國內(nèi)外均主要選用嚙齒類動物（如小鼠、大鼠、沙土鼠）進行實驗研究。

2 動物模型的制作方法

2.1 高脂喂養(yǎng)法 高脂血癥是動脈粥樣硬化發(fā)生的一個危險因素，大量的動物實驗已證明富含膽固醇的飼料可以導(dǎo)致AS，粥樣斑塊可以導(dǎo)致血管壁狹窄，尤其是心腦等重要器官的動脈管壁發(fā)生狹窄或阻塞時，致使心腦等重要器官短暫缺血或梗死。Suzuki［1］選用3只雜種狗，采用高脂飲食喂養(yǎng)建立腦動脈粥樣硬化模型，分別在喂養(yǎng)48個月（n＝2）和55個月（n＝1）后，取組織觀察發(fā)現(xiàn)：顱內(nèi)動脈內(nèi)膜破壞和增生變厚，管腔狹窄；脂質(zhì)病灶處可見內(nèi)吞脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞、膽固醇結(jié)晶和肌內(nèi)膜細(xì)胞，同時可見成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等病理改變。該方法病理過程與人類自然發(fā)病過程相似，但是模型制備耗時過長，且缺血部位及程度不容易控制。

2.2 高脂加手術(shù)法

2.2.1 高脂加結(jié)扎（或夾閉）兩側(cè)頸總動脈（2-vessel occlusion，2VO）法 阻斷雙側(cè)頸總動脈法可作為慢性腦缺血的模型之一，該模型可引起組織病理學(xué)損傷和空間學(xué)習(xí)能力障礙，在人體這種學(xué)習(xí)能力下降可能與海馬錐體神經(jīng)元損傷和死亡有關(guān)［2］。王海濤等［3］選用♂ Wistar大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)造成動脈粥樣硬化模型，36周后實施微動脈夾夾閉兩側(cè)頸總動脈造成腦缺血，45 min后再通，術(shù)后大鼠正常飼養(yǎng)3 d，對實驗動物主動脈及腦組織進行Masson和HE染色，觀察發(fā)現(xiàn)主動脈動脈壁內(nèi)膜明顯增厚，部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落；腦組織大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)深染，核呈梭形或三角形，周邊出現(xiàn)較大空暈，腦皮層有灶性出血伴灶性淋巴細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管萎縮，血管周圍出現(xiàn)較大的腔隙，海馬回區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)深染。由于大鼠Willis環(huán)的腦血管結(jié)構(gòu)，該方法梗死灶不明顯且部位不確定，無法行TTC染色觀察梗死灶及計算梗死體積，模型穩(wěn)定性、重復(fù)性較差。

2.2.2 高脂加大腦中動脈栓塞／再灌注法（middle cerebral artery occlusion／reperfusion，MCAO／R） 線栓法阻斷大腦中動脈，造成大腦中動脈供應(yīng)區(qū)血流中斷，導(dǎo)致局灶性腦缺血，由于該方法不需要開顱，避免了手術(shù)對腦組織的創(chuàng)傷和刺激作用；可以準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時間；且具有穩(wěn)定性強、重復(fù)性高的特點，是目前最為常用的局灶性腦部缺血模型。張克儉等［4］選用♂Wistar大鼠一次性腹腔注射維生素D3（60萬IU·kg－1），與高脂飲食誘導(dǎo)相結(jié)合建立AS大鼠模型，持續(xù)喂食6周后，實施尼龍栓塞法建立MCAO，阻斷1 h后實現(xiàn)再灌注。張小菊等［5］采用HE染色觀察腦組織的病理形態(tài)及免疫組化法檢測腦組織中MMP-9、COX-2的表達，高脂腦缺血組和非高脂腦缺血組的大鼠腦切片可見梗死部位蒼白，梗死中心區(qū)神經(jīng)元減少、胞核固縮、胞質(zhì)淡染，神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，有變性壞死的細(xì)胞溶解消失后殘留的輪廓等細(xì)胞壞死表現(xiàn)；缺血中心區(qū)結(jié)構(gòu)疏松，間質(zhì)水腫；梗死周邊神經(jīng)元及部分膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、空泡變性及胞質(zhì)淡染，小血管擴張充血，周圍少量炎癥細(xì)胞浸潤，高脂腦缺血組較非高脂腦缺血組腦組織損傷程度加重且腦組織中MMP-9、COX-2陽性細(xì)胞表達增加。

2.2.3 高脂加主動脈弓選擇性動脈結(jié)扎法 Zhang等［6－7］選用♂新西蘭大白兔給予高脂飲食喂養(yǎng)，持續(xù)喂養(yǎng)12周，按照結(jié)扎靶血管的不同分別實施單純閉塞右側(cè)鎖骨下動脈椎動脈開口近端、單純閉塞右側(cè)頭臂干左側(cè)頸總動脈開口遠(yuǎn)端和同時閉塞上述兩個部位，1周后在全身麻醉下應(yīng)用Prowler-10微導(dǎo)管配合SilverSpeed-10微導(dǎo)絲在4F造影管的導(dǎo)引下行主動脈弓和靶血管選擇性動脈造影，確認(rèn)靶血管結(jié)扎是否成功以及結(jié)扎后血流動力學(xué)改變情況。主動脈弓及頸總動脈分叉處經(jīng)病理HE染色可見動脈內(nèi)膜明顯增厚甚至凸向管腔，內(nèi)皮排列不規(guī)整，中膜平滑肌遷移，斑塊內(nèi)可見泡沫樣細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶，該研究建立了不同強度的血液動力性低灌注模型，尤其適用于研究AS時血液動力性腦缺血狀態(tài)下側(cè)支循環(huán)形成的發(fā)達程度與相關(guān)機制，為研究AS血管重塑提供了很好的動物模型。

2.3 高脂加藥物法 高脂加內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）注射法：朱磊等［8］選用♂ SD大鼠一次性腹腔注射維生素D3（60萬IU·kg－1）與高脂飼料誘導(dǎo)相結(jié)合建立AS大鼠模型，持續(xù)喂養(yǎng)64d，在正常組、AS組中隨機抽取3只大鼠，水合氯醛麻醉后沿主動脈瓣至髂動脈分支處剝離全長動脈，進行主動脈HE染色病理結(jié)果提示：AS組管腔內(nèi)膜、中膜和外膜分界不清楚，管壁厚薄不一，管腔面部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落，局部內(nèi)皮細(xì)胞聚集成小團塊，管腔內(nèi)見大的血栓形成，血栓內(nèi)見鈣鹽沉積；在d 65參考顧國軍等［9］方法以內(nèi)皮素-1注射法復(fù)制急性腦缺血模型，顧國軍等采用該方法對腦組織冠狀切片，TTC染色顯示ET-1組梗死灶體積為（23.14±2.3）%，經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)ET-1組腦組織缺血區(qū)染色淺，缺血區(qū)與正常組織分界較清楚，形成梗死灶，梗死灶內(nèi)可見明顯的組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)纖維網(wǎng)空泡化且大量神經(jīng)元丟失。梅和珊等［10］在對ET-1誘導(dǎo)的大鼠局灶性腦缺血／再灌注模型研究中發(fā)現(xiàn)該模型操作簡單，造成的腦梗死范圍穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，是一種更接近人類卒中具體情況的較理想的局灶性腦缺血／再灌注模型。

2.4 基因敲除小鼠 基因敲除小鼠加大腦中動脈栓塞／再灌注法（MCAO／R）：隨著基因工程技術(shù)在AS動物模型中的應(yīng)用，近年來，基因工程小鼠被大規(guī)模使用?；蚬こ绦∈笫遣捎没蚬こ碳夹g(shù)將編碼某一特定蛋白質(zhì)的特殊等位基因缺失。最廣泛采用的基因工程小鼠AS模型是載脂蛋白E（ApoE）和低密度脂蛋白受體（LDLR）基因缺陷小鼠。在此基礎(chǔ)上建立小鼠 MCAO，實驗基礎(chǔ)可靠。Kim等［11］，Lu等［12］，Mogi等［13］，Iwai等［14］，曹陽等［15］均采用 ApoE KO小鼠高膽固醇飼喂10周后，再實施MCAO／R法建立小鼠動脈粥樣硬化腦缺血／再灌注損傷模型。Kim等［11］實驗研究發(fā)現(xiàn)喂飼高脂的ApoE KO小鼠和普通飼料的ApoE KO小鼠主動脈經(jīng) Oil red染色，動脈粥樣硬化性損傷面積，分別是（19.41±2.81）mm2、（4.11±0.83）mm2（P＜0.01）；腦組織切片經(jīng)TTC染色梗死體積分別是（101.75±12.06）mm3、（57.73±15.82）mm3（P＜0.05）；AS腦缺血組eNOS-和脂聯(lián)素－陽性細(xì)胞數(shù)量較腦缺血組表達明顯減少。

3 模型的評價方法與指標(biāo)

目前，動脈粥樣硬化腦缺血／再灌注動物模型無統(tǒng)一的評價指標(biāo)，且以AS復(fù)合腦缺血動物模型的基礎(chǔ)實驗報道較少，現(xiàn)將相關(guān)實驗報道中的評價方法及病理生理指標(biāo)進行總結(jié)分析，以便更好的了解該復(fù)合動物模型的病理生理特點，為以后的模型評價、發(fā)病機制、藥物治療作用等實驗研究提供參考與依據(jù)。

3.1 行為學(xué)評分法 神經(jīng)功能損傷評分是診斷和療效評價的重要指標(biāo)，國際腦卒中治療臨床前研究指南（STAIR）指出，在腦缺血藥物研究中，多重指標(biāo)綜合評價的重要性，其中包括行為學(xué)評價。目前對大鼠局灶性腦缺血模型的神經(jīng)功能評分多采用 Bederson等［16］及 Garcia等［17］評分標(biāo)準(zhǔn)，有學(xué)者對其進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)［18］，Garcia評分較Bederson評分，與腦梗死病灶有更高的相關(guān)度，說明Garcia評分可能有利于更全面反映動物神經(jīng)功能的損傷程度。有文獻報道，對小鼠局灶性腦缺血模型的神經(jīng)功能評分［20］可采用Clark［19］評分標(biāo)準(zhǔn)。在臨床神經(jīng)功能損傷評分中，往往要求對整體意識水平、感覺、視覺、運動、共濟等方面進行綜合評價，目前評定腦缺血動物功能和行為往往偏于運動功能［4，11，15］，而忽視了感覺功能等。Bederson評分的局限性即體現(xiàn)在此；Garcia和Clark評分對神經(jīng)功能則進行了較全面的評價，評價指標(biāo)相對固定和客觀，主觀因素的偏倚影響較小，且可操作性好。在局灶性腦缺血神經(jīng)功能評價時，我們應(yīng)盡量選擇Garcia或Clark評分標(biāo)準(zhǔn)。

3．2 TTC染色測定腦梗死面積 TTC染色法對測定腦梗死面積具有直觀性，肉眼即可辨認(rèn)腦梗死灶及腦梗死程度，同時采用圖像分析軟件可計算出腦梗死的面積，是目前實驗研究急性腦缺血的重要觀察指標(biāo)之一。Kim等［11］，Iwai等［14］，Hatcher等［21］等在實驗中研究發(fā)現(xiàn) AS MCAO組較MCAO組腦梗死面積明顯增大。在AS腦缺血模型中評價該指標(biāo)，仍然具有重要的作用。

3.3 組織病理學(xué)檢測 病理形態(tài)學(xué)變化的觀察是確定模型病變的性質(zhì)、程度和評價藥物效應(yīng)的重要部分。目前多采用HE染色法觀察實驗動物主動脈根部和其他不同病變部位或腦組織梗死邊緣區(qū)組織病理學(xué)改變，并利用顯微鏡或透射電鏡技術(shù)觀察主動脈病變或腦組織梗死邊緣區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；TUNEL凋亡法可檢測分析腦缺血半暗帶和梗死灶中心區(qū)凋亡陽性細(xì)胞的數(shù)目。

3.4 影像學(xué)研究 影像學(xué)技術(shù)是腦卒中診斷與治療不可缺少的檢查手段，其中數(shù)字減影血管造影（DSA）、頸動脈及經(jīng)顱彩色多普勒超聲、CT血管造影（CTA）、頭部核磁共振血管成像（MRA）等技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于臨床，對腦梗死的預(yù)防及治療決策起到了至關(guān)重要的作用。目前，在檢測腦缺血動物模型成功與否或觀察藥物對腦血流是否有影響多采用激光多普勒血流監(jiān)測儀（LDF）、激光掃描多普勒血流監(jiān)測，以及激光散斑襯比度成像（LSCI）等技術(shù)，LSCI較其他兩種技術(shù)具有高時空分辨率，且無創(chuàng)、非接觸、無需掃描等優(yōu)勢。Ayata等［22］采用了激光散斑襯比成像技術(shù)監(jiān)測ApoE KO腦缺血小鼠腦血流變化，觀察高脂血癥對腦血管反應(yīng)的破壞及缺血／再灌注的損傷情況。

臨床上常用的主要成像技術(shù)雖然可對動物進行活體成像，但由于分辨率受限，只能觀察到位于腦部淺表的直徑較大的血管，無法對位于深層微小血管結(jié)構(gòu)的變化進行觀察或評估。有文獻報道，同步輻射成像技術(shù)和Micro-CT成像技術(shù)可以解決上述問題，該技術(shù)可觀察到直徑100μm以下的血管，具有很高的空間分辨率，為研究腦部的微血管變化提供了一種先進的手段。管永靖等［23］利用該技術(shù)建立了有效、直觀的活體大鼠腦微血管高分辨率動態(tài)成像體系，為有效進行活體動物腦部微血管結(jié)構(gòu)觀察提供了新方法新途徑。該技術(shù)的發(fā)展無疑對小動物活體成像提供了新的思路和新的方法，也為新動物模型的建立及現(xiàn)有動物模型的穩(wěn)定性、可控性評價提供了有力的證據(jù)。

3.5 腦水腫的測定 根據(jù)實驗要求，缺血或缺血／再灌注一定時間后，即刻斷頭取腦，分別稱取腦濕重和干重。腦水腫也可以間接以血腦屏障（blood-brain-barrier，BBB）破壞的程度來表示。BBB是位于腦血管與腦組織間的一個復(fù)雜結(jié)構(gòu)，主要由腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接、基膜和周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足形成的膠質(zhì)膜和細(xì)胞外基質(zhì)組成。伊文斯藍(lán)（EB）和熒光素鈉（NF）可以用于測定BBB的損傷。正常情況下，EB和NF不能通過BBB，但顱腦損傷后，BBB完整性受到破壞，EB和NF即可進入腦組織間隙，采用分光光度計法和熒光法檢測它們進入腦組織的含量，可定量評價BBB的破壞程度。近年來，研究發(fā)現(xiàn)有諸多因子參與了腦缺血后BBB破壞，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、緊密連接結(jié)構(gòu)（TJ）、水通道蛋白（AQP）、細(xì)胞因子（如 TNF-α、IL）、黏附分子（ICAM）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、纖溶酶原激活物（tPA）等，通過對這些蛋白及因子的檢測可以了解BBB的破壞程度［24］。

3.6 實驗指標(biāo)檢測

3.6.1 血脂指標(biāo) 血脂異常是目前公認(rèn)的導(dǎo)致AS的重要危險因素，血脂指標(biāo)是檢測AS模型是否成立的重要指標(biāo)之一。實驗研究顯示［3］，與腦缺血組相比，AS和AS腦缺血組大鼠的血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）明顯升高（P＜0.01）；高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）明顯降低（P＜0.01）。由于高脂血癥、AS等疾病均可導(dǎo)致血脂的異常改變，血脂指標(biāo)并不能作為AS腦缺血／再灌注復(fù)合模型的特異性指標(biāo)。

3.6.2 氧化應(yīng)激 通過檢測一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）、尿激酶型纖溶酶原激活因子（u-PA）等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化病變可加重腦缺血／再灌注的損傷，即在AS復(fù)合腦缺血／再灌注模型對腦組織的損害程度較單純急性腦缺血／再灌注嚴(yán)重。王海濤等［25］采用Lowry法測定結(jié)果顯示：與腦缺血模型組、AS組比較，AS腦缺血模型組大鼠的腦組織NO含量和NOS活力明顯升高（P＜0.05）；SOD、GSH-Px活性均下降，差異有顯著性（P＜0.01）；而MDA含量明顯升高（P＜0.01）。張克儉等［4］采用SABC免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，MCAO／R后12 h，AS腦缺血組較單純腦缺血組PAI-1在病灶周邊神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達增強，而u-PA在膠質(zhì)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底組織表達減弱，隨時間延長至24 h時表達更加明顯。

3.6.3 炎癥因子 炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖和效應(yīng)，通過炎癥介質(zhì)調(diào)控推動粥樣斑塊病變的程度和斑塊結(jié)構(gòu)的改變，主要參與的炎癥因子有單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細(xì)胞因子（如 TNF-α、IL）、黏附分子（ICAM）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）。MCP-1的活性是白細(xì)胞滲透能力增強的關(guān)鍵步驟；CRP作為體內(nèi)非特異性炎癥標(biāo)志物，是急性炎癥反應(yīng)的最顯著的靈敏性指標(biāo)；張振強等［26］用酶聯(lián)免疫法在復(fù)合腦缺血組與單純腦缺血組組間比較血清中MCP-1、TNF-α和CRP含量，實驗結(jié)果顯示，MCP-1、TNF-α在復(fù)合腦缺血組在缺血3、7 d血清含量均增多，差異有顯著性（P＜0.05）；CRP在復(fù)合腦缺血組織3 d血清含量增多（P＜0.05）。

3.6.4 VEGF、PDGF-BB、vWF、TM、HIF-1α 研究證實，血小板活化、黏附、聚集率增加與缺血性腦梗死發(fā)病率呈正相關(guān)，亦是缺血性腦梗死重要的檢測指標(biāo)之一，以上檢測指標(biāo)的實驗研究大多建立在臨床及單純的急性腦缺血模型基礎(chǔ)上。相關(guān)實驗報道［7］顯示，大鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍化生長因子-BB（PDGF-BB）在該復(fù)合模型中明顯增高，AS導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷后激活血小板使之釋放各種生長因子，包括VEGF和PDGF，皇甫斌等［27］采用RTPCR技術(shù)分析AS腦缺血模型大鼠腦組織的VEGF mRNA表達量及蛋白含量，發(fā)現(xiàn)表達明顯增高，并隨時間規(guī)律性波動，在0.5h迅速升高，6 h出現(xiàn)峰值，12 h及24 h后略有下降但不明顯，與以往實驗比較，VEGF mRNA及蛋白含量峰值提前至發(fā)病后6 h，這可能與AS所形成全身炎癥反應(yīng)有關(guān)。在AS基礎(chǔ)上發(fā)生缺血缺氧時VEGF基因的表達時間及水平較無炎癥反應(yīng)存在時表達時間更短、表達水平更高，這說明AS對缺血性腦卒中時VEGF基因及其蛋白產(chǎn)物的表達有正向調(diào)控作用。CD34＋細(xì)胞在體內(nèi)能參與成體動物的血管新生，具有內(nèi)皮細(xì)胞前提特征CD34＋在AS鼠的缺血局部較單純?nèi)毖M表達偏低，外周血EPC計數(shù)減少，提示在AS腦缺血大鼠中血管的新生能力較無血管病變基礎(chǔ)下缺血的自我修復(fù)作用減弱［5］。假性血友病因子（vWF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的特異性分子標(biāo)志物，vWF增高可促進血小板的粘附與聚集，血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）具有阻止血小板聚集釋放的功能及阻止纖維蛋白形成，實驗研究顯示vWF、TM在正常大鼠腦組織中無明顯表達，但二者在AS基礎(chǔ)上的腦缺血大鼠組織表達明顯增強，TM隨著時間的延長，表達減弱并消失［28］。但缺乏更全面的實驗數(shù)據(jù)來說明該指標(biāo)為AS腦缺血復(fù)合模型的特異性分子標(biāo)志物。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是低氧應(yīng)答狀態(tài)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與機體的病理生理過程。HIF-1α可以誘導(dǎo)糖酵解相關(guān)酶類基因的表達，從而促進無氧代謝；上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生，促進血管新生等，以上功能共同作用能夠提高機體細(xì)胞對低氧狀態(tài)的耐受能力并保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，夏添等［29］運用免疫組織化學(xué)法及RT-PCR技術(shù)檢測HIF-1α的蛋白表達及其mRNA的表達，研究發(fā)現(xiàn)，0.5 h已可見HIF-1α的RT-PCR結(jié)果中HIF-1αmRNA陽性高表達，較假手術(shù)大鼠表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），缺血6 h達峰值，在12、24 h較6 h無明顯差異。免疫組化結(jié)果示HIF-1α蛋白表達同基因表達變化規(guī)律。提示HIF-1α對AS基礎(chǔ)上缺血性腦卒中起保護作用，對AS下發(fā)生的缺血性腦卒中的治療提供了新的途徑。

3.6.5 細(xì)胞凋亡 研究發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的caspase-3［25］在缺血45 min再灌注72 h后，在海馬 CAI區(qū)神經(jīng)元表達增強，早期AS可使caspase-3表達更強，原位末端標(biāo)記證實了凋亡細(xì)胞的表達情況與caspase-3的表達相一致，提示caspase-3表達上調(diào)可能在腦缺血的凋亡機制中發(fā)揮作用，提示早期動脈粥樣硬化可以增加大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)的神經(jīng)元凋亡。

3.6.6 神經(jīng)遞質(zhì) 姜立先等［30］應(yīng)用離體高分辨魔角旋轉(zhuǎn)磁共振波譜（HR-MAS1HNMR）技術(shù)檢測AS兔鎖骨下動脈盜血模型海馬組織代謝產(chǎn)物 N-乙酰－天冬氨酸復(fù)合物（NAA）、膽堿（Cho）、肌酸／磷酸肌酸（Cre）、乳酸（Lac）、γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）等共振峰的變化。研究顯示：與普通飲食組及高脂飲食組比較，模型組兔海馬區(qū)NAA、GABA明顯降低（P＜0.05），Glu明顯升高（P＜0.05），其他代謝產(chǎn)物變化不明顯。其中NAA主要存在神經(jīng)元和軸突內(nèi)，可以反映神經(jīng)元的數(shù)量和功能，Glu是興奮性氨基酸，它的釋放可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，GABA是抑制性氨基酸，能抑制神經(jīng)興奮，對神經(jīng)毒性起一定的保護作用。該實驗采用AS兔鎖骨下動脈盜血模型模擬臨床AS患者，由于動脈狹窄或閉塞導(dǎo)致的大腦后循環(huán)慢性低灌注狀態(tài)，觀察海馬神經(jīng)代謝變化，為AS腦缺血的研究提供了可靠的實驗理論依據(jù)。

4 討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于單純AS動物模型和單純腦缺血動物模型的研究較多，也較成熟，在很大程度上促進了AS和腦缺血病理機制、藥物評價、臨床治療等方面的研究。但是單一疾病的動物模型并不完全符合臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展，臨床多見同時多種疾病共存，大多數(shù)腦缺血是在某些基礎(chǔ)病變條件下發(fā)生的，如AS、高血壓、高脂血癥、糖尿病等，因此研究復(fù)合疾病的動物模型可以更接近臨床，更加能模擬臨床。隨著認(rèn)識的加深，科研工作者也越來越重視建立復(fù)合模型進行實驗研究，如AS基礎(chǔ)上的腦缺血、高脂血癥基礎(chǔ)上的腦缺血、糖尿病合并腦缺血等。

但復(fù)合模型的建立依然存在一些問題，目前還未建立起被行業(yè)所認(rèn)可的AS腦缺血模型，即“金標(biāo)準(zhǔn)”，也未建立該復(fù)合模型的完整評價方法與系統(tǒng)；同時對一些實驗指標(biāo)由于研究的方法和手段、動物模型及觀察時間等的差異，所得結(jié)論也并不一致；部分建立在AS腦缺血復(fù)合模型的實驗指標(biāo)檢測結(jié)果較簡單（如與 BBB、腦水腫發(fā)生相關(guān)的 MMP-2、MMP-9等蛋白水解酶），未能很好的說明該指標(biāo)在復(fù)合模型中較單一模型的變化特點、趨勢及其優(yōu)勢；在以后的研究中，利用復(fù)合模型對AS、缺血性腦卒中及實驗指標(biāo)三方面的相關(guān)性研究將對缺血性腦血管病的病理機制有更深入的了解，為AS下發(fā)生的缺血性腦卒中的治療提供了新的途徑。

與臨床緊密結(jié)合選擇所要檢測的實驗指標(biāo)，臨床試驗證明，高同型半胱氨酸（HCY）致AS引起腦梗死的發(fā)生有著密切的關(guān)系［31］；多種脂肪細(xì)胞因子參與并促進了AS斑塊的形成和增加了腦卒中的風(fēng)險，張帆等［32］臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)臟脂肪素、抵抗素、IL-6、IL-8水平與頸動脈斑塊不穩(wěn)定性呈正相關(guān)，而血清脂聯(lián)素水平與頸動脈斑塊不穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，這些指標(biāo)與腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定顯著相關(guān)，有望成為評價斑塊穩(wěn)定性及預(yù)測腦梗死發(fā)生的理想生化指標(biāo)。在類似的復(fù)合動物模型上，它們是否能作為評價AS下發(fā)生的缺血性腦卒中的評價斑塊穩(wěn)定性及預(yù)測腦梗死發(fā)生的理想生化指標(biāo)，以及是否可以作為治療的新途徑，需要進一步探索與研究。

總之，不同的檢測指標(biāo)反映不同的發(fā)病及作用機制，在具體實驗研究中，應(yīng)采取多指標(biāo)相互配合的原則，針對不同的作用機制選取，才能更準(zhǔn)確反映出該疾病的本質(zhì)。以上實驗方法從AS腦缺血／再灌注的某些發(fā)病機制出發(fā)建立了相應(yīng)的動物模型及相關(guān)檢測指標(biāo)，為探索和研究AS腦缺血／再灌注動物模型提供了良好的科學(xué)依據(jù)與研究思路，結(jié)合臨床發(fā)病機制及病變特點建立更加符合人類疾病的動物模型將具有重大意義及重要價值。

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