国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

2類多巴胺受體對心肌缺血后處理保護作用的影響及機制*

2014-01-23 03:43李鴻珠郝曉敏張麗敏陳俊亭
中國應用生理學雜志 2014年4期
關鍵詞:乳鼠后處理培養(yǎng)液

李鴻珠,高 君,郝曉敏,張麗敏,陳俊亭

缺血后處理(ischemic postconditioning,PC)是指心肌缺血后,在再灌注早期,對心臟進行重復幾次短暫的再灌注/缺血循環(huán)的處理方法[1]。動物實驗已證實此方法能減輕再灌注后心肌的損傷[2]。

多巴胺受體(dopamine receptor,DR)屬于七個跨膜區(qū)域組成的G蛋白偶聯(lián)受體家族[3],根據多巴胺受體的生化和藥理學特性,將其分為D1樣和D2樣受體,其中D1樣受體又可分為D1和D5受體亞型,主要位于突觸后,受體與腺苷酸環(huán)化酶正性耦聯(lián),與G蛋白中刺激亞單位(Gs)結合,激活腺苷酸環(huán)化酶(AC),使cAMP增高,刺激磷脂酶C,從而激活鈣通道,使細胞內鈣增高[3]。D2樣受體可分為 D2、D3、D4受體亞型,分別位于突觸前和突觸后,與腺苷酸環(huán)化酶負性耦聯(lián),與 Gi/Gq作用,抑制AC,使 cAMP降低,抑制鈣通道,調節(jié)鉀通道[3]。當今國內外對于DR的研究多集中在精神神經系統(tǒng),心血管系統(tǒng)對于DR的研究較少,主要涉及其對高血壓、心臟驟停等影響[4]。我們在前期研究中發(fā)現,在大鼠心肌缺血/再灌注損傷過程中,DR2表達增加[5];DR2激活通過抑制線粒體、死亡受體途徑及MAPK通路減輕乳鼠心肌細胞缺血/再灌注損傷及通過促進PKCε轉位參與大鼠缺血后處理的心肌保護作用[6-9]。但是,DR2激活在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞的缺血后處理中的作用及機制尚未見報道。因此,本實驗利用原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞建立缺血后處理模型,探討DR2激活在心肌缺血后處理中的作用及相關機制,這將為缺血性心臟病的防治提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar乳鼠(2~3 d,雄性,8~15 g),由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

Bromocriptine(Bro)和 Haloperidol(Hal,Sigma),Western及IP細胞裂解液(Beyotime),DMEM培養(yǎng)液(Hyclone),DR2抗體(Satan),p38、p-p38、JNK、p-JNK抗體(Cell Signaling Technology),LDH、SOD、MDA測定試劑盒(南京建成),Anexin-V凋亡檢測試劑盒(北京寶賽),其它試劑均為分析純。

1.3 主要器材

高速低溫離心機(Beckman),US-640型紫外分光光度計(Beckman),倒置相差顯微鏡(Olympus),培養(yǎng)箱 MCO-17AICO2(SANYO),Western blot電泳槽(美國BIO-RAD),S-1300-U凈化工作臺等。

1.4 原代心肌細胞培養(yǎng)

用70%的酒精浸泡消毒Wistar乳鼠,開胸取心,D-Hank’s液清洗2次,剪碎放入10 ml離心管中;加入心肌5倍體積的0.25%胰酶,37℃水浴消化12min,共消化4~5次;除第一次外,每次收集的細胞懸液,放入等體積的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化后,1500 r/min離心 15 min,棄上清,用含 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液將沉淀吹打為單細胞懸液,經200目篩網過濾去除未消化組織塊。用差速貼壁分離法去除成纖維細胞,將純化心肌細胞計數后,以 5×106cells/cm2接種于培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)。隔天換液,取第4天的細胞進行實驗。

1.5 心肌細胞缺血后處理模型的建立及分組

正常對照組(Control):細胞正常培養(yǎng),未施加任何因素,培養(yǎng)時間同實驗組;模擬缺血/再灌注組(ischemia/reperfusion,I/R):心肌細胞模擬缺血 3 h,再灌6 h處理。(模擬缺血缺氧液為無血清、無糖培養(yǎng)基,pH=6.8,置于缺氧罐中,通入 95%N2,5%CO2);模擬缺血后處理組(ischemic postconditioning,PC):方法同缺血/再灌注組,在缺血結束再灌前連續(xù)進行3次5 min間隔的再灌注/再缺血處理,繼之恢復持續(xù)灌注;PC+DR2激動劑(Bromocriptine,Bro)組(PC+Bro):同缺血后處理組,在再灌注前10 min加入 Bro,后同 PC組;PC + DR2抑制劑(Haloperidol,Hal)組(PC+Hal):同缺血后處理組,在再灌注前10min加入Hal,后同PC組;PC+DR2抑制劑+DR2激動劑組(PC+Hal+Bro):方法同缺血后處理,在再灌注前20 min加入Hal,在再灌注前10min注入 Bro。

1.6 Western blot檢測蛋白表達情況

取各組心肌細胞,PBS洗滌后加入全細胞裂解液,冰浴 40 min,4℃,15 000 r/min離心 15 min,取上清進行蛋白質定量。取50μg蛋白樣品于10%SDSPAGE凝膠電泳;隨后轉印于 PVDF濾膜上,用5%脫脂奶粉,37℃封閉1 h;用封閉液稀釋一抗,4℃震蕩過夜;TBST稀釋二抗(1/2 000的羊抗兔IgG二抗,堿性磷酸酶標記),室溫振蕩孵育2 h;最后顯色,凝膠成像系統(tǒng)下拍照,計算條帶光密度值,蛋白表達水平以其與GAPDH光密度比值來表示。

1.7 LDH、SOD活力及 MDA含量的測定

取各組細胞的培養(yǎng)液,用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度:標準品為牛血清白蛋白;按試劑盒說明書操作;紫外分光光度計上讀出吸光度(OD)值,計算細胞的LDH和SOD活力以及MDA水平。

1.8 透射電鏡觀察心肌細胞形態(tài)學改變

用0.25%胰酶消化細胞 4 min,PBS洗滌1次,2 000 r/min離心 10 min后棄上清收集細胞;4℃,2.5%戊二醛固定;1%鋨酸固定,常規(guī)乙醇、丙酮逐級脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,鉛鈾雙重染色,透射電鏡下觀察心肌細胞的超微結構并攝片。

1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

取各組心肌細胞,0.25%胰酶消化,PBS洗滌2次后調整細胞密度為1×106cells/L,制成單細胞懸液;加入由100μl Binding Buffer和 FITC標記的Annexin-V(20μg/ml)10μl,室溫避光 30min;加入 PI(50 μg/ml)5μl,避光 5 min;加入 400μl Binding Buffer,立即用流式細胞儀(FACScan)進行定量檢測。

1.1 0 統(tǒng)計學分析

實驗數據以均值±標準差(ˉx±s)表示,全部數據統(tǒng)計采用SPSS 10.1統(tǒng)計軟件包進行,采用方差分析及配對t檢驗判斷其差異顯著性。

2 結果

2.1 不同組DR2蛋白表達變化

(1)DR2蛋白表達變化用 DR2/GAPDH表示,與Control組(0.49±0.06)相比,I/R組 DR2蛋白表達增加(0.74±0.11,P<0.01);(2)與 I/R組比較,PC組 DR2蛋白表達進一步增加(1.19±0.10,P<0.01);(3)Bro上調 PC引起的 DR2蛋白表達增加(1.86±0.07),Hal則可取消 Bro的這種作用(0.77±0.08,圖 1)。

Fig.1 Protein levels of DR2(n=4)I/R:Ischemia/reperfusion;PC:Ischemic postconditioning;PC+Bro:Ischemic postconditioning+Bromocriptine;PC+Hal:Ischemic postconditioning+Haloperidol;PC+Hal+Bro:Ischemic postconditioning+Haloperidol+Bromocriptine**P<0.01 vs controlgroup;##P<0.01 vs I/R group;△△P<0.01 vs PC group;▲▲P<0.01 vs PC+Bro group

2.2 不同組LDH和SOD活性以及MDA含量的變化

(1)與 Control比較,I/R顯著增加 LDH活性和MDA含量,降低 SOD活性(P<0.01);(2)與 I/R組比較,PC顯著降低LDH活性、MDA含量,升高SOD活性(P<0.01);(3)與 PC組比較,Bro進一步降低LDH活性、MDA含量,升高 SOD活性(P<0.01),Hal則可取消Bro的這種作用(表1)。

2.3 各組心肌細胞超微結構變化

Control組:核膜清楚,染色質均勻分布,線粒體結構完好;I/R組:線粒體腫脹和空泡化,肌絲溶解,脊斷裂,細胞核固縮,染色質高度凝聚、邊緣化;PC組:核膜結構較完好,染色質部分凝聚,少量線粒體空泡化;PC+Bro組:細胞損傷程度較PC組減輕;PC+Hal和PC+Hal+Bro組:細胞超微結構變化同PC組相似(圖 2)。

Tab.1 Changes of LDH and SOD activity and MDA content in cellmedium(ˉx±s,n=8)

Fig.2 The ultrastructure of cardiomyocytes using transmission electronmicroscopy(×8 000)A:Control;B:Ischemia/reperfusion(I/R);C:Ischemic postconditioning(PC); D: Ischemic postconditioning+Bromocriptine(PC+Bro);E:Ischemic postconditioning+Haloperidol(PC+Hal);F:Ischemic postconditioning+Haloperidol+Bromocriptine

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

(1)正常組心肌細胞凋亡率僅為 6.53%±0.57%;(2)I/R組心肌細胞凋亡率為 65.63% ±2.89%,明顯高于正常對照組(P<0.01);(3)與 I/R組比較,PC組心肌細胞凋亡率明顯減少(54.50%±1.72%,P<0.01);(4)與 PC組比較,Bro進一步降低細胞凋亡率(30.71%±2.41%,P<0.01);Hal則取消 Bro的這種作用(41.81%±2.63%,圖 3)。

Fig.3 Detection the apoptosis rate of cardiomyocytes by FCM(n=6)I/R:Ischemia/reperfusion;PC:Ischemic postconditioning;PC+Bro:Ischemic postconditioning+Bromocriptine;PC+Hal:Ischemic postconditioning+ Haloperidol;PC+Hal+Bro:Ischemic postconditioning+Haloperidol+Bromocriptine**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs I/R group;△△P<0.01 vs PC group;▲▲P<0.01 vs PC+Bro group

2.5 Western blot檢測各組p-p38和p-JNK活性的變化

(1)與正常組相比,I/R增加 p-p38和 p-JNK的活性(P<0.01);(2)與 I/R組比較,PC降低 p-p38和p-JNK的活性(P<0.01);(3)與 PC組比較,Bro進一步降低p-p38和p-JNK的活性,Hal則可取消Bro的這種作用(圖 4,表 2)。

Fig.4 The changes of p-p38 and p-JNK activities in defferent groups(n=4)C:Control;I/R:Ischemia/reperfusion;PC:Ischemic postconditioning; PC + Bro: Ischemic postconditioning +Bromocriptine; PC+ Hal: Ischemic postconditioning +Haloperidol;PC+Hal+Bro:Ischemic postconditioning+Haloperidol+Bromocriptine

Tab.2 Results analysis of p-p38 and p-JNK expressions in cardiomyocytes from different groups(ˉx±s,n=4)

3 討論

缺血性心臟病嚴重危害人類健康,盡早恢復血流是減輕缺血心肌損傷的關鍵,但是再灌注療法受缺血組織血管再通時間的限制,并存在再灌注損傷等問題。因此,減輕再灌注損傷成為醫(yī)學界亟待解決的重大問題[10,11]。2003年,Zhao等在犬心肌缺血后再灌注前進行3次30 s的再灌注,保護冠狀動脈內皮功能,限制心肌梗死范圍,稱為缺血后處理[1]。目前已在多種屬動物模型上證實缺血后處理是在缺血后實施的強有力的內源性心臟保護現象,但機制不詳。本實驗利用乳鼠心肌細胞建立缺血后處理模型,觀察DR2激活在心肌缺血后處理中的作用并探討其機制。

透射電鏡結果顯示:在I/R后乳鼠心肌細胞出現線粒體腫脹和空泡化,肌絲溶解,脊斷裂,細胞核固縮,染色質高度凝聚、邊緣化;同時,細胞培養(yǎng)液中LDH漏出增多。這些結果均表明I/R導致心肌細胞發(fā)生明顯的損傷。LDH外漏程度可反映細胞損傷程度;SOD活性可反映機體清除自由基和抗脂質過氧化的能力;MDA含量可反映氧自由基產生和組織的受損程度。本研究結果顯示:與Control組相比,I/R組培養(yǎng)液中MDA含量顯著增加、SOD活性明顯降低,這表明I/R性心肌損傷與自由基生成增多有關。與I/R組比較,PC組LDH活性和MDA含量顯著降低,SOD活性明顯升高;并且透射電鏡結果顯示:核膜結構較完好,染色質部分凝聚,少量線粒體空泡化;這說明PC可減輕心肌細胞I/R損傷,其機制與清除自由基相關。

大量動物實驗和臨床研究證明,PC可誘導觸發(fā)因子釋放,經多條細胞內信號轉導途徑的介導,作用于多種效應器,影響氧自由基產生、鈣超載等I/R損傷的關鍵環(huán)節(jié)而發(fā)揮心肌細胞保護作用[11]。主要的信號通路包括磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)、絲裂素活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPKs)、蛋白激酶 C(protein kinase C,PKC)、蛋白激酶 G(protein kinase G,PKG)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、酪氨酸激酶和JAK/STAT等[11]。

MAPKs通路是生物體內重要的信號轉導系統(tǒng)之一,參與細胞生長、分裂、分化、增殖、凋亡等多種生理過程[7],其主要包括 ERK、p38和 JNK三條途徑,其中,ERK被激活后主要與細胞增殖與分化相關,p38與 JNK被激活后主要與細胞凋亡相關[12]。本研究結果顯示:I/R組心肌細胞凋亡率顯著升高,p-p38和p-JNK活性均明顯上調,而PC降低細胞凋亡率,下調p-p38、p-JNK的活性,這表明 PC通過抑制p-p38和p-JNK的活性減輕心肌細胞I/R損傷誘導的細胞凋亡。

本實驗結果還顯示:Bro(DR2的激動劑)可進一步增加PC減輕心肌I/R誘導的細胞損傷和凋亡以及增強機體的抗氧化能力;另外,Bro也可增強PC抑制p-p38和p-JNK活性的能力。

本實驗過程中,PC處理的各組比Control和I/R組所用時間延長15 min,但是眾所周知,PC對 I/R損傷具有保護作用,因此,與I/R組相比,PC處理的各組的心肌損傷是減輕的。

綜上所述,DR2激活參與PC減輕心肌I/R誘導的細胞損傷和凋亡,其機制與下調p-p38和p-JNK的活性有關。結合我們前期實驗結果,激活心肌DR2有望為缺血性心臟病的防治提供新靶點。

[1] Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition ofmyocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):H579-H588.

[2] Yang XM,Proctor JB,Cui L,et al.Multiple brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways[J].J Am Coll Cardiol,2004,44(5):1103-1110.

[3] LiHZ,Han LP,Jiang CM,etal.Effectof dopamine receptor-1 on apoptosis of cultured neonatal rat cardiomyocytes in simulated ischemia/reperfusion[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2008,102(3):329-336.

[4] 李鴻珠,高 君,白淑芝,等.1類多巴胺受體活性變化對細胞凋亡 Fas/Fas-L通路的影響 [J].哈爾濱醫(yī)科大學學報,2011,45(2):103-108.

[5] 李鴻珠,徐長慶,韓麗萍,等.大鼠心肌多巴胺受體在缺氧-復氧時表達變化及其意義 [J].中國病理生理雜志,2007,23(12):2322-2326.

[6] LiHZ,Guo J,Gao J,etal.Role of dopamine D2 receptors in ischemia/reperfusion induced apoptosisof cultured neonatal rat cardiomyocytes[J].JBiomed Sci,2011,18:18.

[7] 高 君,魏 璨,陳愛東,等.2類多巴胺受體激活對細胞凋亡的影響及與MAPK通路的關系[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,7(11):4878-4882.

[8] Gao J,Guo J,LiH,etal.Involvementof dopamine D2 receptors activation in ischemic post-conditioning-induced cardioprotection through promoting PKC-εparticulate translocation in isolated rathearts[J].Mol Cell Biochem,2013,379(1-2):267-276.

[9] 魏 璨,高 君,陳愛東,等.多巴胺受體(DR2)激活對乳鼠心肌細胞缺氧再灌注損傷的保護作用及其機制[J].中國應用生理學雜志,2013,29(4):289-293.

[10]景友玲,王艷蕾,段國賢,等.缺血預處理對肢體缺血/再灌注時肺損傷的保護作用[J].中國應用生理學雜志,2011,27(1):19-22.

[11]劉秀華.缺血后處理內源性心臟保護的研究進展[J].生理學報,2007,59(5):628-634.

[12]陳建勇,王 聰,王 娟,等.MAPK信號通路研究進展 [J].中國醫(yī)藥科學,2011,1(8):32-34.

猜你喜歡
乳鼠后處理培養(yǎng)液
漢防己甲素對先天性巨結腸乳鼠炎癥的改善作用及對JAK2/STAT3通路的影響
車身接附點動剛度后處理方法對比
從一道試題再說血細胞計數板的使用
果樹防凍措施及凍后處理
調整蔗糖、硼酸和pH值可優(yōu)化甜櫻桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)液
乏燃料后處理的大廠夢
不同培養(yǎng)液對大草履蟲生長與形態(tài)的影響研究
乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法的再改良
新生昆明乳鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)
苦參素對缺氧/復氧損傷乳鼠心肌細胞氧化應激和細胞凋亡的影響
山西省| 兰考县| 察隅县| 犍为县| 收藏| 太康县| 共和县| 朝阳县| 安顺市| 福海县| 乌兰察布市| 聂拉木县| 和静县| 苏尼特右旗| 武穴市| 东源县| 眉山市| 无棣县| 周宁县| 萝北县| 丰原市| 米易县| 昌乐县| 云梦县| 玉环县| 六枝特区| 彭州市| 溧水县| 金昌市| 长垣县| 天柱县| 高碑店市| 胶南市| 岑巩县| 昌图县| 建德市| 和平县| 中方县| 绥宁县| 祁门县| 九龙城区|