熊延連，熊艷蕾，李遙金，唐福州，王若峰，趙押金，王 翔

合理適當?shù)倪\動能夠降低多種疾病的發(fā)病率與死亡率［1-2］。而運動對相關心血管因素的改善作用被認為是這種保護作用的基礎。與此相反，運動誘導的猝死等疾病被認為與多種心血管功能障礙有直接關系。在運動誘導的猝死病例中，往往伴隨著心室纖顫等心律失常的現(xiàn)象［3］。目前，學術界普遍認為運動導致的冠狀動脈痙攣、血栓等現(xiàn)象所導致的心肌局部供血不足是誘導致命性心律失常的最主要病因［3］。然而，對心血管暢通和氣體運輸起著至關重要作用的紅細胞的相關功能是否在運動過程中發(fā)生改變，運動誘導的多種心血管疾病與紅細胞功能損傷之間的關系仍有待研究。

本文通過對不同運動條件下細胞抗氧化能力改變，及不同細胞組分受氧化損傷程度的檢測評估了自由基誘導的運動性氧化應激對大鼠紅細胞的影響。對膜蛋白巰基水平、膜脂質過氧化水平和膜蛋白SDS-Page電泳條帶變化進行了分析。此外對不同剪切力下紅細胞變形性（elongation index，EI）進行了檢測。通過上述研究為力竭運動條件下由于組織局部缺血缺氧導致的休克、死亡等運動性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

肝素鈉和PVA購于美國Sigma公司；電泳設備及相關耗材購于美國 Bio-rad公司。過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、SH及 DMA檢測試劑盒均購于南京凱基生物公司；激光旋轉細胞變形儀LORCA購自荷蘭RR Mechatronics公司；動物跑臺購自淮北正華公司。

1.2 實驗動物與分組

選用雄性SD大鼠30只（8周齡，體重200～250 g，第三軍醫(yī)大學提供），國家標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由進食及飲水。相對濕度45%～55%，室溫（22±5）℃，光照時間 8：00～20：00的條件下飼養(yǎng)。適應性喂養(yǎng)5 d后，大鼠隨機分為3組（n＝10）：對照組（control，C），適度運動組（moderate running exercise，MRE）和力竭運動組（exhaustive running exercise，ERE）。

大鼠跑步運動在特制的跑臺上進行，動物跑臺由馬達驅動，可調節(jié)跑步速度和坡度。力竭運動組大鼠運動參照Davies等的運動模型［4］，大鼠運動的前20 min保持5%的坡度和20 m／min的速度，20 min后調整為15%的坡度和25 m／min的速度，直至運動力竭。力竭標準參照Thomas等的報道，置于平面后不能完成翻正反射。適度運動組大鼠在5%的坡度和20 m／min的速度下跑40 min。對照組大鼠靜坐于跑臺中，不進行運動。

對照組和運動組的大鼠采用心臟取血的方法采集血液。用 PBS洗滌4次然后3 000 r／min離心3 min，獲取紅細胞，冷凍備用。

1.3 紅細胞膜蛋白提取

取1ml洗滌后的壓積紅細胞置于60ml預冷至4°C的低滲磷酸緩沖液（pH 7.4，7.5mmol／L磷酸緩沖液）中，加入20μmol／L PMSF抑制水解蛋白酶活性，混合均勻后在4°C下破溶1.5 h。然后20 000×g離心20min，洗滌4～5次后此得到白色的 RBC膜，BCA法測定膜蛋白濃度。

1.4 CAT、SOD、GSH、膜蛋白 SH與膜脂 DMA檢測

按照試劑盒操作說明，樣品提取好后，加入DTNB反應液，后測412 nm處吸光值。并通過標準曲線計算胞內GSH與膜蛋白SH含量。

在紅細胞裂解液中加全血體積2倍的無水乙醇（2ml），在漩渦振蕩器上充分混勻30 s。再加全血體積2倍的三氯甲烷（2 ml）漩渦振蕩器上充分混勻1min，1 500×g離心10 min。取上層液體（CAT與SOD抽提液），按照試劑盒操作說明檢測 CAT與SOD活力。

膜脂質過氧化程度通過TBA試劑盒檢測。取上述裂解液100μl為加樣量，空白組則不加TBA反應液，以532 nm處的凈吸光值計算MDA濃度。脂質過氧化程度產(chǎn)物以每毫克血紅蛋白所對應的 MDA含量表示。

1.5 紅細胞膜蛋白SDS-Page電泳

電泳采用5%～15%的線性梯度膠，還原性電泳樣品經(jīng)含DTT的上樣緩沖液充分還原后上樣，非還原性電泳樣品緩沖液不含DTT，上樣量為5μg。電泳條件為70 V轉120 V恒壓電泳?？捡R斯亮藍R250染色，凝膠經(jīng)脫色后用GS-800 Calibrated Densitometer掃描成像，Quantity One軟件進行條帶分析。

1.6 紅細胞變形性檢測

提前打開儀器預熱30 min，使內部溫度達到37℃后進行檢測。取10～20μl壓積RBC，加入1ml 15%PVP溶液（mol wt 360 000；Sigma，St.Louis，MO），混勻。通過激光照射旋轉中的紅細胞，根據(jù)激光衍射圖譜計算紅細胞在3 Pa和30 Pa剪切力下的伸長指數(shù)（elongation index，EI）：

公式中L和W分別為衍射圖的長度和寬度。紅細胞EI值越大，代表它在相同剪切力作用下形變越大，具有更好的變形性。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)都從3組或3組以上的重復實驗中得出，以均值±標準差（ˉx±s）的形式表示。組間統(tǒng)計學顯著性差異通過 Origin 7.5軟件的 one-way ANO-VA分析。

2 結果

2.1 運動對大鼠紅細胞抗氧化能力的影響

我們對不同運動條件下大鼠紅細胞中3種代謝物質的檢測結果表明：與對照組和適度運動組相比，力竭運動導致大鼠紅細胞酶類抗氧化物SOD（P＜0.05，表 1）和 CAT（P＜0.01）活性的顯著升高，于此同時，大鼠紅細胞內GSH含量顯著下降（P＜0.01）。在適度運動狀態(tài)下，大鼠紅細胞抗氧化能力與對照組并無顯著性差異。

Tab.1 Erythrocyte antioxidant parameters in different exercised groups（ˉx±s，n＝10）

2.2 運動對膜脂質過氧化和膜蛋白巰基含量的影響

我們通過TBA法檢測膜脂質MDA水平，結果表明，力竭運動導致大鼠紅細胞膜脂過氧化產(chǎn)物MDA水平顯著升高（P＜0.01，表 2）。紅細胞膜蛋白含有豐富的SH，它們對維系RBC膜上眾多酶類和功能蛋白的正常結構功能起到重要作用。與對照組（C）相比，力竭運動后紅細胞膜蛋白SH含量顯著下降（P＜0.05）。在適度運動狀態(tài)下，大鼠紅細胞脂質過氧化程度和膜蛋白巰基含量與對照組相比并無顯著性差異。

2.3 運動對大鼠紅細胞膜蛋白電泳條帶的影響

在非還原性SDS-APGE電泳結果中我們發(fā)現(xiàn)，力竭運動后紅細胞膜上出現(xiàn)高分子聚合條帶（high molecularweight，HMW），與此同時，許多小分子條帶豐度顯著降低或消失（圖1箭頭所示）。而在普通運動組和對照組HMW的含量非常少。還原性SDSAPGE電泳結果中各組條帶差異不明顯，力竭運動組的HMW條帶基本上消失。

Fig.1 SDS-PAGE（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis）analyses of erythrocytemembrane proteins in different groups HMW：High molecular weight；C：Control group；MRE：Moderate running exercise group；ERE：Exhaustive running exercise group.The arrows indicate protein clusters or degradation after exercise-induced oxidative stress

2.4 運動對紅細胞變形性的影響

如圖2所示，在3 Pa（A）和30 Pa（B）條件下，力竭組大鼠紅細胞變形性（EI分別為0.314±0.013 at 3 Pa and 0.534±0.009 at 30 Pa）顯著低于對照組（0.41±0.01 at3 Pa and 0.571±0.008 at30 Pa；P＜0.05 and P＜0.01，respectively）和適度運動組。為了探討蛋白交聯(lián)與運動誘導的氧化損傷之間的關系，我們對各組大鼠紅細胞在含5.0mmol／L二硫蘇糖醇 （dithiothreitol，DTT）的緩沖液中孵育30min。結果表明，DTT處理后力竭組紅細胞變形性出現(xiàn)顯著回復（P＜0.05）。在適度運動狀態(tài)下，大鼠紅細胞脂變形性與對照組相比并無顯著性差異。

Fig.2 RBC deformability as reflected by the elongation index in different groups under shear stressof3 Pa（A）and 30 Pa（B）C：Control group；MRE：Moderate running exercise group；ERE：Exhaustive running exercise group*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

3 討論

運動，尤其力竭運動過程中機體產(chǎn)生大量自由基，導致包括肌肉、心血管損傷在內的多種運動性氧化應激反應［5-7］。在對運動性氧化損傷的研究過程中，紅細胞因其在機體內清除自由基、維系氧化還原平衡過程中所起的重要作用逐漸受到人們的關注［8-10］。研究力竭運動過程中紅細胞抗氧化、清除自由基能力的變化，自身受到氧化損傷程度的變化，以及氧化應急條件下紅細胞力學性質和攜氧功能的改變將對運動誘發(fā)的休克、缺氧損傷、紅細胞凋亡等多種生理和病理現(xiàn)象的探索提供重要的理論依據(jù)。

紅細胞內擁有包括酶類和非酶類抗氧化物在內的抗氧化體系。正常情況下，它們協(xié)同作用能夠清除包括 H2O2、O·2-和 OH·在內的絕大部分自由基，維持細胞的氧化還原平衡。本實驗中，力竭運動后大鼠紅細胞內GSH含量顯著降低，表明伴隨著運動強度的增加紅細胞通過GSH維系氧化還原平衡的能力逐漸減弱。這種削弱一方面是由于清除自由基過程中GSH的大量消耗；另一方面，由于紅細胞內GSH-GSSH循環(huán)體系的還原力主要來自于糖代謝HMP途徑產(chǎn)生的NADPH。由此推測，在力竭運動過程中紅細胞的能量代謝途徑也可能發(fā)生相應改變。

RBC膜上有很多蛋白和酶類以半胱氨酸殘基作為必須氨基酸，自由基攻擊導致的SH氧化交聯(lián)可損傷上述蛋白及酶的功能，從而導致紅細胞結構破壞和功能紊亂。本研究室的前期工作表明，人紅細胞膜蛋白SH水平與RBC粘彈性呈正相關關系［11］。由此可見，紅細胞膜蛋白SH水平在維系RBC功能的過程中起著至關重要的作用。本實驗中，力竭運動后大鼠紅細胞膜SH含量顯著降低，表明在力竭運動過程中自由基攻擊導致膜蛋白SH交聯(lián)產(chǎn)生-SS-。SH含量的降低一方面表明紅細胞膜蛋白通過膜上大量巰基集團抵抗氧化損傷能力的降低；另一方面，也意味著紅細胞膜蛋白已經(jīng)受到ROS攻擊而發(fā)生結構上的改變。此外，力竭運動后大鼠紅細胞脂質過氧化產(chǎn)物MDA水平高出對照組和適度運動組一倍以上。表明在力竭運動過程中大鼠紅細胞膜脂質發(fā)生了嚴重的脂質過氧化反應。由于膜流動性與膜脂肪酸的飽和程度密切相關，PUFA的氧化將導致紅細胞流動性的下降。此外，脂質過氧化過程中生成的ROS將誘導紅細胞膜組分（如膜酶和膜骨架蛋白）的進一步損傷。

正常情況下，由于體內存在一定數(shù)量的衰老紅細胞，在非還原性電泳條帶中都會有少量高分子聚合物條帶的出現(xiàn)。然而，在力竭運動組電泳條帶中可明顯地看到HMW條帶的出現(xiàn)，而且伴隨著包括Band 3在內的多種小分子條帶的減弱與消失。而在含有DTT的還原性SDS-PAGE電泳中，力竭運動組HMW條帶顯著的減弱。由于DTT常被用于蛋白質中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質分子內或分子間二硫鍵。這意味著力竭運動所誘導的蛋白聚集主要是通過-S-S-鍵連接。-SH的氧化交聯(lián)會對紅細胞形態(tài)結構的穩(wěn)定和多種代謝功能造成嚴重損傷。有研究表明，紅細胞膜蛋白-SH水平與細胞粘彈性呈正相關關系。在本實驗中，力竭組紅細胞-SH的大量減少，誘導細胞膜蛋白交聯(lián)的同時紅細胞變形性與攜氧功能都出現(xiàn)了顯著地降低。而在對細胞進行體外還原處理后，膜蛋白交聯(lián)程度明顯減弱，與此同時，紅細胞的變形能力與攜氧功能都出現(xiàn)了明顯的恢復。由此可見，由自由基攻擊所引發(fā)的膜蛋白巰基交聯(lián)所導致的多種膜蛋白的損傷是力竭運動誘導的紅細胞結構和功能性損傷的重要原因。

紅細胞的變形能力是影響血液流動和粘滯性的最主要因素［12］。紅細胞良好的變形性是保障機體微循環(huán)暢通，生理功能健全，以及維持生命運動的基礎。在多種生理病理情況下，由紅細胞變形性下降誘導的微循環(huán)障礙，尤其是在代謝活躍的器官（心、腦、肺）這種影響更加明顯。洪平等實驗發(fā)現(xiàn)，適度運動條件下模擬平原訓練和高原訓練都能提高SD大鼠RBC變形性［13，14］。本實驗中，由于進行的是一次性運動，適度運動組大鼠紅細胞變形性并未發(fā)現(xiàn)顯著提升。此前有研究表明，耐力運動可降低血管一氧化氮合酶活性，對動脈粥樣硬化內皮細胞分泌功能產(chǎn)生有益影響［15］。而本實驗中，力竭運動后大鼠RBC變形性顯著下降，這與之前的研究結果相吻合［16］。此外，為了揭示力竭運動誘導紅細胞變形性下降的原因，本研究對各組紅細胞進行了DTT處理。結果發(fā)現(xiàn)，處理后紅細胞變形性出現(xiàn)明顯的恢復。由于DTT具有極強的還原性，常被用于蛋白質中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質分子內或分子間二硫鍵，對紅細胞的膜蛋白巰基具有極強的保護作用。這也就意味著，力竭運動過程中紅細胞變形性的降低與氧化應激引起的膜蛋白巰基交聯(lián)有密切關系。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)一次性力竭運動能夠誘導大鼠紅細胞產(chǎn)生嚴重的氧化應激反應，進而影響紅細胞變性能力，成為力竭運動誘導的多種心腦血管疾病發(fā)生的潛在致病因素。本研究對力竭條件下由組織局部缺血缺氧所導致的休克、死亡等運動性疾病的研究提供了理論依據(jù)。

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