項 云，屠平光，章嘯君，樓芳芳，杜喜忠，胡旭進

(金華市農(nóng)業(yè)科學研究院畜牧所，浙江 金華321000)

細胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學研究中應用最為廣泛的技術(shù)，成纖維細胞具有易培養(yǎng)，增殖快，形態(tài)和遺傳性能穩(wěn)定，可長期、完整、大量地保存生物體遺傳信息的特點［1］。因此，通過構(gòu)建家畜品種成纖維細胞庫的途徑保存或拯救其種質(zhì)資源是目前最為理想的方法之一［2］。1997年，Wilmut 等用體細胞核移植轉(zhuǎn)基因法獲得世界上首例轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。轉(zhuǎn)基因動物克隆以體細胞核移植技術(shù)作為基礎(chǔ)，目前體細胞克隆轉(zhuǎn)基因牛(Cibelli，1998)，山羊(Baguisi，1999)，豬(Polejaeva，2000;Lai，2002年)等相繼獲得成功［3］。而成纖維細胞是核移植中的一種理想供體細胞。

金華豬作為中國優(yōu)良的地方豬種之一，在育種方面具有巨大的潛力。本試驗研究了金華豬耳緣組織成纖維細胞的分離與原代、傳代培養(yǎng)及生物學特性，獲得了能在體外正常傳代培養(yǎng)的細胞系，為動物克隆、轉(zhuǎn)基因動物及其他細胞生物學研究提供細胞資源。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM(Dulbecco's Modium Essential Medium)培養(yǎng)液;胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS);青霉素、鏈霉素混合液(含青霉素10000 U/mL、鏈霉素10 μg/mL);0.25%胰蛋白酶溶液;PBS 液等均為Hyclone 公司產(chǎn)品。Giemsa 染液(Giemsa stain)為Fluka 公司產(chǎn)品;完全培養(yǎng)液:含100U/ml 青霉素鈉、100ug/ml 硫酸鏈霉素、10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液;凍存液:含10%DMSO 和20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液;液氮罐YDS-30;倒置顯微鏡OLYMPASCKX41;二氧化碳培養(yǎng)箱Thermo311 型;超低溫冰箱Thermo702 型。

1.2 試驗方法

1.2.1 取材及處理 活體采集3 ～5日齡金華豬耳緣皮膚組織，用75%酒精充分清洗消毒，無菌條件下剪取大小為0.5 cm×0.5 cm 耳部皮膚，置于含雙抗的PBS 液中，反復漂洗3 ～5 次，直到漂洗液清亮透明為止，吸去PBS 液，加入中性蛋白酶10 mL，4℃消化過夜，用眼科鑷細心分離皮膚表層與真皮層，剪成0.5 ～1 mm3大小的組織塊;用吸管將組織塊轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管內(nèi)，注入新鮮含雙抗的PBS 溶液，重復洗滌3 次，棄最后1 次洗滌液，取沉淀組織備用。

1.2.2 組織塊貼壁培養(yǎng)法 向離心管內(nèi)加入37℃預溫、含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液2 mL，用無菌吸管將組織塊轉(zhuǎn)移至專用培養(yǎng)瓶中(均勻鋪開，間距5 mm 左右)，吸去多余培養(yǎng)液，倒置培養(yǎng)瓶，加培養(yǎng)液3 mL，放入37℃、5% C02培養(yǎng)箱中4 h，待組織塊充分吸附于培養(yǎng)瓶底部后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，慢慢加入37℃預溫培養(yǎng)液5 mL，重新置于5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)，48 h 后觀察細胞生長和污染情況，及時換液，72 h 后觀察細胞生長情況。

1.2.3 原代細胞的分離與傳代 將細胞培養(yǎng)液從細胞板中吸出，用DPBS 液清洗貼壁細胞，清除殘留的DMEM 細胞培養(yǎng)液和壞死脫落細胞，加入500 μL胰酶消化3 min。顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，待細胞變圓時，立即加入800 μL DMEM 液終止酶消化，離心(1000 r/min)，棄上清液，加DMEM 液，按1∶4比例，分別接種于四孔板中，傳代完成。

1.2.4 耳緣成纖維細胞的冷凍與復蘇 根據(jù)上述方法消化細胞，1000 r/min 離心后，棄上清液，加入4℃預冷的冷凍液1 mL，4℃保存0.5 h，－20℃保存2 h，放入－80℃過夜保存，第2 d 移入液氮中保存。復蘇時，從液氮中取出，放入37.5℃恒溫水浴鍋中1 min，加入DMEM 培養(yǎng)液清洗細胞2 次，然后加入細胞培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞活力測定 將凍存前及復蘇后的傳代細胞制成細胞懸液，取0.5 mL 放入小離心管中，加入0.02 g/mL 的Trypan blue 染液0.1 mL 混合，2 min后用血球計數(shù)板顯微鏡下直接測定細胞存活率。

1.4 細胞形態(tài)觀察(Giemsa 染色法) 將滅菌蓋玻片放入一次性細胞培養(yǎng)皿中，將適量真皮成纖維細胞懸液加入培養(yǎng)皿中，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待真皮成纖維細胞在蓋玻片上長成良好單層后，取出玻片浸入無水甲醇中固定15 min，然后用新無水甲醇沖洗，隨后放入純Giemsa 染液中染色10 min。從Giemsa 染液中取出玻片經(jīng)干燥和二甲苯透明。最后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察細胞類型、性狀、大小、核質(zhì)比例、染色質(zhì)和核仁大小及生長狀態(tài)。

1.5 細胞生長曲線 采集生長良好的真皮成纖維細胞，采用細胞傳代方法制成細胞懸液。經(jīng)計數(shù)后，將密度為2.53 ×104/mL 細胞懸液接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL。每隔24 h 取出3 孔細胞分別進行細胞計數(shù)，求平均數(shù)，連續(xù)計數(shù)8 d，以培養(yǎng)時間為橫軸，每日細胞數(shù)平均值為縱軸，作曲線圖，即得到體外培養(yǎng)真皮成纖維細胞的生長曲線。

1.6 數(shù)據(jù)分析 對細胞凍存前后的存活率進行t檢驗，用SPSS 進行χ2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 成纖維細胞形態(tài)學觀察 經(jīng)原代組織塊貼壁法培養(yǎng)耳緣組織成纖維細胞，4 d 即可見到真皮組織塊邊緣向外游離生長出單個細胞，細胞呈圓形，隨后伸展梭形、多邊形。培養(yǎng)7 d 即可明顯看到大量細胞向外植塊邊緣生長。隨細胞游離出來的細胞增多，生長速率逐漸加快，15 d 后，細胞基本布滿培養(yǎng)瓶。倒置顯微鏡下觀察，可見細胞以梭形和多角形為主，細胞飽滿，胞核成卵圓形，細胞向四周呈放射狀生長，形成致密單層細胞。細胞經(jīng)胰酶消化后形狀變圓。經(jīng)過2 ～3 次消化傳代后即可獲得純化的成纖維細胞。

2.2 成纖維細胞Giemsa 染色 高倍鏡下觀察，細胞質(zhì)呈淡藍色，胞體近中央處有橢圓形細胞核，可見2 ～4 個核仁，細胞輪廓清晰，伸展良好，細胞排列緊密規(guī)則。采用Giemsa 染色，細胞質(zhì)與細胞核具有明顯的顏色對比性，能清晰顯示出細胞形態(tài)及分裂的不同時相，能有效判斷細胞的生長狀態(tài)與健康狀況。

2.3 傳代培養(yǎng)耳緣組織成纖維細胞的生長特性傳代培養(yǎng)的成纖維細胞與原代細胞其形態(tài)及生長速度均無明顯差異，細胞質(zhì)生長與分裂依然十分旺盛。單層細胞傳代4 d 后便可重新長成單層細胞，對0.25%胰蛋白酶消化的敏感性比原代培養(yǎng)細胞明顯增強。從體外培養(yǎng)的耳緣真皮成纖維細胞對數(shù)生長曲線可看出，細胞生長前24 h 為遲緩期，第2 ～4 d為生長期，第6 d 后進入平穩(wěn)期。

2.4 成纖維細胞的冷凍保存與復蘇結(jié)果 利用改良血球計數(shù)板測定細胞凍存前24 h 及細胞復蘇后24 h 的平均存活率與貼壁率。統(tǒng)計結(jié)果表明，金華豬耳緣組織成纖維細胞凍存前和復蘇后平均存活率分別為95.6%和93.8%，細胞復蘇24 h 后，85%以上細胞貼壁于培養(yǎng)瓶底生長。由此可見，凍存和復蘇后傳代細胞活力影響較小，細胞生長狀態(tài)良好。

3 小結(jié)與討論

在動物細胞原代培養(yǎng)發(fā)展的過程中，動物原代細胞培養(yǎng)主要分為2 種方法，組織塊貼壁培養(yǎng)法和酶消化法。本試驗采用組織塊培養(yǎng)法獲得金華豬耳緣成纖維細胞，該方法簡單有效，獲得的成纖維細胞可以在體外至少傳代10 代。前期雖有少量上皮細胞存在，但根據(jù)不同類型細胞對胰酶的敏感度不同進行純化，培養(yǎng)2 ～3 代后即可獲得較純的成纖維細胞［4］。傳代細胞在培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)典型，呈現(xiàn)出“S”型生長曲線，表明細胞生長正常。

本試驗材料采自仔豬耳緣皮膚組織，仔豬皮膚組織修復能力較強，傷口很快愈合，不影響供體動物健康，且還可進行再次取樣。因此，新生豬成纖維細胞的取材方式比胎兒成纖維細胞方便，更適合于珍稀物種與瀕危動物的細胞培養(yǎng)與核移植胚胎提供核供體。細胞培養(yǎng)中需要的培養(yǎng)液、血清及其他營養(yǎng)物質(zhì)，不同生產(chǎn)廠家、產(chǎn)品批號、對細胞培養(yǎng)有一定影響［5］。

本試驗采用Hyclone 公司生產(chǎn)的高糖DMEM 培養(yǎng)液，血清含量為15%的培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)，傳代后改在培養(yǎng)基中添加10%的血清進行培養(yǎng)。結(jié)果表明，DMEM 培養(yǎng)的金華豬耳緣組織成纖維細胞優(yōu)先從組織塊中移出，細胞生長狀態(tài)良好，與張小建等(2007)［6］研究結(jié)果基本一致。

哺乳動物細胞冷凍保存方法中，普遍采用DMSO 作為冷凍保護劑。選擇冷凍劑及冷凍方法一般著重考慮是否有利于細胞在最短時間內(nèi)脫水，減少細胞內(nèi)大冰晶的形成［7］。

本試驗采用10%DMSO +20%FBS DMEM 培養(yǎng)液作為細胞冷凍液，4℃、－20℃、－80℃平衡后直接投入液氮中保存。細胞凍存前與復蘇后的存活率無顯著差異。

動物細胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)已成為一項比較成熟的技術(shù)，該技術(shù)在生物學研究中具有廣闊前景。本試驗成功建立了金華豬耳緣組織成纖維細胞系，該細胞系的建立，使金華豬這一重要物種資源在細胞水平上得以保存，為后期核移植和轉(zhuǎn)基因的研究提供了基礎(chǔ)材料。

［1］盧桂強，李海華.我國地方家禽遺傳種質(zhì)資源保存的研究概況［J］.上海畜牧，2005，5:52－54.

［2］關(guān)偉軍，馬月輝.頻危畜禽品種細胞庫的構(gòu)建與鑒定［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報，2003，5:5－8.

［3］周向梅，馬月輝，關(guān)偉軍，等.云南矮馬耳緣成纖維細胞系的建立及其生物學特性［J］.動物學報，2004，50(5):863－868.

［4］Yang X，Jiang S，F(xiàn)arrell D，et al.Nuclear transfer in cattle:effect of nuclear donor cells cytoplast age to culture and embryo transfer［J］.Mol ReProd Dev，1993，35(1):29－36.

［5］斯佩科特D I..細胞實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學出版社，2001.

［6］張小建，李鍵.張興友.牦牛成纖維細胞的體外培養(yǎng)研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2007，46(3);344－347.

［7］任芳麗，李煜，張涌.牛成纖維細胞體外培養(yǎng)與凍存［J］.黃牛雜志，2002，28(1):8－10.