李小東，郭 慶，高璟英，張 婉，武冬梅，劉云峰，章 毅

老年人是糖尿病高發(fā)人群，在全部心腦血管病死亡的病例中，除直接與糖尿病有關外，其余13%的病例與高血糖有關，高血壓合并糖尿病成為腦卒中死亡的重要原因［1］。近年來有關糖尿病治療研究引起了人們的關注，其中有很多胰島移植的研究。隨著分子生物學技術的發(fā)展，雖然各個方面取得了很大進步，但其移植效果并不理想，在人體的胰島移植中，活性能保持一年以上不超過40%［2］。其主要原因是胰島分離純化后活性不高，移植后的排斥反應以及免疫抑制劑對大鼠胰島的毒性作用［3］。因此獲得足量、活性良好的胰島非常重要。本實驗采用膠原酶P消化胰腺及Histopaque 1077分離液直接離心分得大鼠胰島，并對其活性及功能進行評價。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD 大鼠，體重250g～300g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑 膠原酶P 購自瑞士羅氏公司；雙硫棕（DTZ）、HEPES、葡萄糖、多聚賴氨酸（分子量15～30萬）購自美國Sigma公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；DispaseⅡ購自美國Amresco公司；青鏈霉素（雙抗）購自北京索萊寶公司；AO－PI購自南京建成生物科技有限公司；大鼠胰島素放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術研究所。

1.3 主要儀器 超凈工作臺（北京世安科技林凈化技術有限公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（北京博奧恒信生物科技有限公司）；臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡IX81（日本奧林巴斯IX51）。

1.4 方法

1.4.1 原代大鼠胰島及胰島細胞分離培養(yǎng) 無菌條件下，大鼠斷頭處死，迅速打開胸腹，在膽總管匯入十二指腸的入口處用止血鉗夾住，經(jīng)膽總管緩慢注入13mL 4 ℃的1mg／mL膠原酶P溶液，38 ℃水浴消化11min，取出立即加入20 mL 4℃培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）終止消化，劇烈振搖胰腺至細沙狀，用孔徑350μm 的濾網(wǎng)過濾，1 200r／min，離心2 min，去上清，加入10 mL 分離液Histopaque 1077至管中重懸組織，將10mL 1640培養(yǎng)基慢慢順管壁注入管中，3 200r／min，離心23min。收集界面間的懸浮胰島，在含10%胎牛血清，100U／mL 青霉素，100μg／mL鏈霉素的1 640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃，5%CO2，100%濕度的孵箱中培養(yǎng)［4］。將胰島用含3 mmol／L EDTA 的無鈣鎂PBS溶液脫鈣后，加入DispaseⅡ（5mg／mL）酶液，培養(yǎng)箱孵育6min，用4℃培養(yǎng)液終止消化，吹打使胰島分散，1 000 r／min，離心2min，將胰島細胞接種在培養(yǎng)皿中，按胰島培養(yǎng)條件培養(yǎng)［4］。

1.4.2 大鼠胰島的DTZ 純度鑒定 DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO，用Hanks液（pH7.8）1∶1 000稀釋，0.22μm 孔徑濾膜過濾，與胰島制備物混合，室溫10 min后鏡檢［5］；大鼠胰島的AO／PI活性鑒定：用Hanks液配制儲存液，AO：670μmol／L，PI：750μmol／L，4 ℃避光保存，使用前取0.01mL AO 與1mL PI混合，用Hanks液10倍稀釋，0.22μm 孔徑濾膜過濾，與胰島混合10min，在熒光顯微鏡下采用490nm 激發(fā)光，510nm 發(fā)射光鏡檢［6］。

1.4.3 胰島素分泌實驗 配置葡萄糖濃度分別是2.8mM，8.3mM，16.7mM 的KRBH 孵育液。方法：①取6個Eppendorf管標號，各加1mL 2.8mM 葡萄糖的KRBH 液，每管挑入5個胰島，37℃孵育30 min 后，棄上清。②每管再加入1 mL 2.8 mM 葡萄糖的KRBH 液孵育，37℃孵育30 min，收集上清，標號，－20℃保存待測。③依次給予8.3mM 葡萄糖、16.7mM 葡萄糖孵育，方法同上，收集上清，－20℃保存待測。用放射免疫法檢測上述待測樣品。

1.4.4 激光共聚焦檢測細胞內部鈣離子濃度 胰島用Fluo 4－AM（4μM）染料在37℃的條件下孵育半小時，孵育完用含2.8 mM 糖的Hanks液輕輕沖洗兩遍，防止染液殘留影響之后的細胞內鈣離子濃度的測定，再加入2mL 含2.8mM 糖Hanks液。使用奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡IX81觀察，設置激光波長494 nm，發(fā)射波長516nm。所得到的比值F／F0（細胞熒光減去背景熒光和自身熒光）反應細胞內鈣離子濃度的變化［4］。

2 結 果

2.1 原代大鼠胰島 一般只離體培養(yǎng)7d，在體視顯微鏡下觀察，胰島質地飽滿，呈橢圓形或圓形，透光率較小，直徑在100～300μm；胰島細胞在倒置顯微鏡下觀察呈球形，部分細胞之間相連成細胞團。胰島中包含α，β，δ和pp細胞，但是在體積上有明顯差別，β細胞是α細胞的2～3倍，δ細胞比α細胞更小，β細胞直徑11～13.5μm。

2.2 DTZ 和AO／PI對胰島純度及活性鑒定 分別在40 倍，100倍的顯微鏡下觀察，可見全部胰島被DTZ 染成猩紅色；在490nm 激發(fā)光，510nm 發(fā)射光的熒光顯微鏡下觀察，培養(yǎng)過夜的胰島97%以上可被AO／PI染成綠色。

2.3 胰島素分泌實驗 胰島分別在葡萄糖濃度為2.8mM（2.8G），8.3mM（8.3G），16.7mM（16.7G）的KRBH 溶液中孵育半小時后，所測胰島素值分別為：（11.7±1.4）uIU／mL，（38.2±8.7）uIU／mL，（86.3±5.1）uIU／mL，胰島素分泌量隨葡萄糖濃度增加而增加。

2.4 激光共聚焦技術檢測胰島細胞中鈣離子濃度 實驗中，在2.8mM 葡萄糖（n＝10）的基礎上，8.3mM 葡萄糖（n＝10）可以明顯升高胰島細胞內的鈣離子濃度；16.7 mM 葡萄糖（n＝10）在8.3mM 的葡萄糖的基礎上進一步的升高了胰島細胞中的鈣離 子 濃 度。2.8Gvs8.3G（P＜0.0 5）；2.8Gvs1 6.7G（P＜0.001）；8.3Gvs 16.7G（P＜0.01）。

3 討 論

胰島細胞移植為治療胰島素依賴性糖尿病開辟了一條新的途徑［7］。胰島移植不僅可糾正糖代謝紊亂，還能避免因血管病變引起的眼、腎、腦和心血管并發(fā)癥，但胰島的分離純化是一個較復雜的過程，所獲胰島的產(chǎn)量和質量受很多因素影響，稍有偏差即會直接影響治療效果，因此備受關注［8］。如何獲得高純度及高活性的胰島仍是亟待解決的問題。

目前成年大鼠胰島分離純化多采用機械研磨與Ficoll密度梯度離心法［9］，而本實驗采用單一的Histopaque－1077是即用型的，減少了Ficoll不同密度分離劑的配制及除菌的步驟。由于純化時只有Histopaque－1077和1640培養(yǎng)基兩個密度，純化梯度易于形成，使得胰島的純化變得簡便，縮短了分離大鼠胰島的時間。此法減少了多步分離過程中不確定的因素對胰島質量的影響，盡可能快的給予離體胰島營養(yǎng)，利于獲得純度高，活性良好的胰島。Histopaque－1077 較Ficoll等能提供一個更好的滲透環(huán)境，能更好地保持胰島的活性與功能。實驗證實，膠原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分離得到的大鼠胰島純度高、活性、功能良好。同時我們總結了大鼠胰島分離純化過程中一些體會：①胰腺灌注的成功與否是分離純化胰島的關鍵，文獻報道多采用4.5號頭皮針穿刺灌注，為防止針尖過于銳利，刺破膽管壁致膠原酶外溢，我們采用與此針頭同樣粗細的細塑料管（尖端較鈍）進行灌注。②灌注時用線結扎位置要在最低一支膽管與主干的匯合支以下，以防止部分酶液倒流至肝內。③應采用4℃的膠原酶灌注，因溫度高時膠原酶過早消化胰管和腺泡，灌注好的胰腺應置于0℃的冰袋上剔除非胰腺組織，這些非胰腺組織無法消化且會黏附正常胰腺組織，不利于過濾。④胰腺消化分散后，應立即加入20mL 4℃培養(yǎng)液，混勻終止消化。如果培養(yǎng)液用量太少，則不能終止膠原酶的作用，造成過度消化，破壞胰島完整性，影響分離效果［10］。

DTZ是一種螯合鋅、銅、鉛等的指示劑，因為大鼠的胰島β細胞含鋅，DTZ染液可將胰島染成猩紅色，所以DTZ對胰島是特異性染色［5］；AO 為浸潤性染料（膜通透性），可侵入活細胞與雙鏈DNA 結合發(fā)出綠色熒光；PI為排斥性染料（膜不通透性），不能進入活細胞，與死亡（膜通透性改變）細胞的核酸結合，發(fā)出紅色熒光［6］。實驗中，所有胰島可被染成猩紅色，表明用此種實驗方法分得的胰島純度較高；AO／PI可將97%以上胰島染成綠色，表明胰島活性良好。葡萄糖依賴性的胰島素分泌實驗證實了胰島功能良好。胰島細胞中鈣離子濃度會升高會促進胰島素分泌。我們對胰島細胞中鈣離子濃度進行檢測后發(fā)現(xiàn)，利用高濃度葡萄糖刺激胰島時，可明顯升高胰島中鈣離子濃度。利用膠原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分離液離心純化胰島是一種較簡單可靠的方法。

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