王兆永，劉佰純，田曉豐，池 琦，魏麗娟，王春田，曹 宏＊

核糖核苷酸還原酶小亞基M2在腫瘤中表達及意義的研究進展

王兆永1，劉佰純1，田曉豐2，池 琦1，魏麗娟1，王春田1，曹 宏2＊

（1．吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長春130041；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長春130033）

核糖核苷酸還原酶（Ribonucleotide Reductase．RR）在DNA合成、修復(fù)及細胞增殖中起關(guān)鍵作用，近來被認為是癌癥治療的重要靶點。RR包含3個亞單位，分別是大亞基RRM1、小亞基RRM2和小亞基p53R2。RRM2亞基不僅和DNA的合成密切相關(guān)，對惡性腫瘤生物學(xué)行為、轉(zhuǎn)移潛能和腫瘤耐藥的產(chǎn)生都具有影響．在絨癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌、直腸癌、乳腺癌等多種人體癌組織中發(fā)現(xiàn)RRM2的表達水平有異常升高的情況，抑制RRM2的高表達，可以降低RR酶的活性，抑制癌細胞的生長，增加腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和逆轉(zhuǎn)耐藥。針對RRM2在腫瘤中高表達的抗腫瘤藥物主要有：3－AP、吉西他濱、RRM2的小干擾RNA、RRM2反義寡核苷酸及RRM2的反義cDNA，通過對RRM2的深入研究將有助于在基因水平及分子水平上揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的機制，為腫瘤的治療提供一個新的策略。

1 RRM2的結(jié)構(gòu)和功能

腫瘤的形成和生長均與細胞的生長相關(guān)，而細胞的分裂、增殖及分化有賴于DNA的合成，核糖核苷酸還原酶（RR）存在于所有的生物細胞中，它是唯一催化核糖核苷酸轉(zhuǎn)化為脫氧核糖核苷酸的酶，它能夠?qū)⒑颂呛塑账岬?＇－二磷酸催化轉(zhuǎn)化成2＇－脫氧核糖核苷酸，而脫氧核糖核苷酸是DNA合成和修復(fù)的原材料，因此RR是DNA合成和修復(fù)通路中的限速酶［1－3］。在核苷酸代謝過程中發(fā)揮核心作用，對細胞的分裂、增殖及分化具有重要作用。根據(jù)金屬輔助因子不同，RR可分為三類，而基于序列同源性和別構(gòu)調(diào)節(jié)機制，第I類又可進一步分為la，lb，和Ic三個亞類，人、鼠和大腸桿菌等的RR屬于la亞類。RR全酶結(jié)構(gòu)包括大亞基α和小亞基β，形成α2β2的異四聚體結(jié)構(gòu)后方具備活性。現(xiàn)已鑒定出人的RR全酶由一個大亞基Ml（RRM1）和一個小亞基（RRM2或P53R2）組成［4］。大亞基RRM1包括底物和變構(gòu)效應(yīng)物位點，且含有直接供給電子的琉基，控制著底物的特異性及酶活性的開／關(guān)，是腫瘤抑制基因，也是吉西他濱（Gemcitabine）的分子靶點。RRM2基因位于人染色體2p25→p24，全長10．3kb［1，5］，它是一個同源二聚體，由8個長螺旋結(jié)構(gòu)互相折疊形成，其內(nèi)包含兩個相同的二價鐵核心和一個酪氨酰自由基，這些對催化過程中觸發(fā)電子運輸非常必要，通過酪氨酸殘基的苯環(huán)形成特異的自由基而參加催化反應(yīng)，其具有攜帶接觸抑制區(qū)，控制底物轉(zhuǎn)化的功能［6］。研究表明，RRM2除參與DNA合成外，對惡性腫瘤生物學(xué)行為、轉(zhuǎn)移潛能和腫瘤耐藥的產(chǎn)生都具有影響［7］。日本研究人員于2000年首先克隆出RR的另一個小亞基P53R2，它的基因在結(jié)構(gòu)上和RRM2有80%以上的一致性［4，8，9］。當DNA損傷后P53R2可取代RRM2，與RRM1形成RR全酶，為DNA合成提供dNTPs，并進一步修復(fù)DNA［10］。

2 RRM2在腫瘤中的表達及意義

有研究應(yīng)用傳統(tǒng)的免疫組化方法，首次在妊娠滋養(yǎng)細胞疾?。℅TD）中檢測出了RRM2的表達部位和表達水平。近年來鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院崔金全教授用免疫組化、免疫印跡和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）方法，即從mRNA和蛋白水平證明RRM2在葡萄胎和絨癌細胞中存在高表達。Mark S等［11］使用小干擾RNA（small interfering RNA，即siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾，通過抑制胰腺癌細胞中RRM2表達，增強吉西他濱誘導(dǎo)的細胞毒性，同時構(gòu)建了胰腺癌的原位移植瘤模型，通過全身給藥抑制腫瘤的RRM2表達，結(jié)果表明RRM2的siRNA與吉西他濱的有協(xié)同作用，顯著抑制腫瘤的生長，增加腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。他們研究證實了腫瘤細胞中RRM2的表達對吉西他濱化療耐藥至關(guān)重要，并首次證明了以siRNA全身給藥為基礎(chǔ)的治療，可增強核苷類抗癌藥的療效；另有研究表明在胰腺癌（尤其是不能手術(shù)的胰腺癌）患者中，RRM2的表達也起著關(guān)鍵的預(yù)測作用［12］；最近藤田等［13］的研究表明，對手術(shù)切除的胰腺癌患者檢測RRM2mRNA的表達水平，如其表達水平較低，則可提示這類患者使用吉西他濱化療有效；Fisher［14］從一個前瞻性數(shù)據(jù)庫中隨機選擇95例在2000年1月至2008年10月之間接受了胰十二指腸切除術(shù)胰腺癌患者的腫瘤標本，并對腫瘤樣本中RRM1，RRM2進行免疫組化分析，最終得出結(jié)論：RRM1表達與總生存期（OS）無關(guān)，腫瘤中RRM2的高表達與胰腺癌切除后無復(fù)發(fā)生存率（RFS）和總生存期（OS）減少相關(guān)，這些生物標志物可能有助于個性化的輔助治療。但是xie等［15］的研究似乎得出了與之相矛盾的結(jié)果，他們的研究小組對117例接受了腫瘤切除手術(shù)的胰腺癌患者的腫瘤標本構(gòu)建腫瘤組織芯片，同時采用免疫組織化學(xué)方法測定RRM2蛋白表達量，并分組進行陰性、陽性對照，采用Kaplan－Meier法估計總生存期（OS）和無進展生存期（PFS），采用Cox比例風險模型研究RRM2表達價值，最終得出結(jié)論：在胰腺癌組織中的RRM2蛋白表達既不能判斷可切除胰腺癌患者預(yù)后，也不能預(yù)測這些患者輔助吉西他濱治療是否獲益。Morikawa等［16］對117例膀胱標本的組織芯片進行RRM2免疫染色。觀察14例非腫瘤性膀胱上皮，均未見RRM2染色陽性；4例低級別膀胱上皮癌（UC）也未見RRM2染色陽性；83例高級別膀胱上皮癌（UC）中，69例RRM2染色陽性，其中3例鱗狀細胞癌RRM2染色均呈陽性，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的13例膀胱上皮癌（UC）中，12例RRM2染色陽性。在進行了根治性切除術(shù)膀胱癌患者患者中，RRM2過度表達與肌層浸潤顯著相關(guān)。對15例異型反應(yīng)的膀胱炎及25例原位膀胱癌的小的活體標本進行RRM2免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果在15例異性反應(yīng)膀胱炎標本中1例RRM2染色陽性（6．7%），在25例原位膀胱癌標本中24例RRM2染色陽性（96%）。他們的研究結(jié)果表明，RRM2蛋白頻繁的過度表達可能在膀胱癌中發(fā)揮作用，它將是一種新型的膀胱癌的診斷標志物和潛在的治療靶點。Morikawa［17］研究小組同樣對胃癌進行了研究，他們選取了114例胃癌標本，應(yīng)用RRM2單克隆抗體和組織芯片進行免疫組織化學(xué)分析來確定RRM2蛋白表達情況，并對RRM2的表達與臨床病理因素之間的相關(guān)性進行統(tǒng)計學(xué)分析。再利用RRM2小干擾RNA轉(zhuǎn)染3個胃癌細胞系，MKN－1，MKN－7和SNU－719（分別為低分化，分化良好和Epstein－Barr病毒相關(guān)GC），用MTT法檢測其對細胞生長的影響。結(jié)果：檢測114例胃癌標本中52例RRM2蛋白表達，而在正常胃小凹上皮RRM2不表達，RRM2的表達與肌層浸潤，血管侵犯，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。應(yīng)用小分子干擾RNA抑制RRM2表達，結(jié)果表明在所有這3個的胃癌細胞系的細胞生長均減少。Morikawa研究表明RRM2蛋白表達與胃癌惡性潛能有關(guān)，它在胃癌細胞的生長發(fā)揮了重要作用，RRM2可以作為一種新穎的診斷／預(yù)后的標記物和治療胃癌的一個潛在的治療靶分子。為了進一步研究RRM2和結(jié)直腸癌（大腸癌）的相關(guān)性，Liu等［18］將結(jié)腸癌的臨床研究結(jié)果同RRM2的表達聯(lián)系起來，他們收集了437例結(jié)直腸癌標本進行回顧性的研究，其中217例來自美國希望之城？？國家醫(yī)學(xué)中心（COH），220例來自浙江大學(xué)。他們應(yīng)用免疫組化（IHC）來確定的RRM2蛋白表達水平，用實時定量PCR來驗證。通過siRNA下調(diào)RRM2表達水平顯著并特異的抑制細胞的生長，也降低了HT－29和HCT－8細胞的粘附能力。結(jié)果表明RRM2是預(yù)測大腸癌的一個獨立預(yù)后因素，也是一個潛在的判斷結(jié)直腸癌的化療反應(yīng)好壞的預(yù)測指標。另一個來自中國上海微創(chuàng)外科中心（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院）研究小組研究了RRM2亞基在大腸癌中的作用及其在紫外線引起的DNA損傷修復(fù)中的作用。結(jié)果表明，RRM2過度表達與浸潤深度，低分化型，轉(zhuǎn)移階段呈正相關(guān)。RRM2過度表達可能與大腸癌的進展相關(guān)，通過siRNA使RRM2基因沉默，可以抑制大腸癌細胞的增殖和侵襲，RRM2在大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移可能發(fā)揮重要作用，這是一個潛在的治療大腸癌的策略。研究人員得出一個結(jié)論，RRM2在大腸癌的發(fā)生和紫外線引起的DNA損傷修復(fù)中可能是一個促進因素。他們的研究表明，RRM2基因沉默抑制大腸癌細胞的增殖和侵襲，RRM2可能在大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，抑制其功能可能是一個潛在的治療大腸癌的策略。也有研究表明，RRM2在乳腺癌和乳腺癌前病變中也存在的高表達，乳頭漿液性溢液涂片RRM2免疫組化染色可作為乳腺腺癌的鑒別手段［19］。最新的研究也表明RRM2在小細胞肺癌、膽管癌、上皮性卵巢癌組織中的表達均有不同程度的增多，因只少數(shù)報道，有待于進一步研究證實。

3 針對RRM2的抗腫瘤藥物研究現(xiàn)狀

RR抑制劑類是目前最有開發(fā)前景的抗腫瘤藥物之一［20］。抑制RR的機制主要有2點：①直接滅活RRM2亞單位的酪氨酞自由基。②通過離子絡(luò)合作用對RRM2亞單位的離子中心發(fā)生不可逆性抑制作用。3－氨基吡啶－2－甲醛硫代縮氨基脲（3－AP）是目前最有效的RR抑制劑，對多種人類及小鼠腫瘤均有顯著療效，并能增加順鉑、環(huán)磷酞胺等抗腫瘤藥物的活性，但對其毒理作用機制，尤其對生殖毒性和遺傳毒性研究，尚不夠全面系統(tǒng)。吉西他濱（Gemcitabine）是另一種核苷酸還原酶抑制劑，主要作用于腫瘤細胞的DNA合成期，即細胞周期的S期，在一定的條件下，可以阻止Gl期向S期的進展。目前臨床主要用于治療局部進展性或轉(zhuǎn)移性小細胞肺癌和不能手術(shù)的晚期胰腺癌等。近年來siRNA抗癌治療已成為研究的熱點，關(guān)于RRM2的siRNA研究也越來越多。眾多的實驗證明小分子干擾RNA（siRNA）可以增加胰腺腺癌對吉西他濱的敏感性，并減輕腫瘤細胞的侵襲性。據(jù)報道利用具有高效轉(zhuǎn)染反義核苷酸功能的最新脂質(zhì)體將寡核苷酸轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞內(nèi)，明顯抑制了細胞生長，降低了RRM2蛋白、mRNA的表達。研究證實，RRM2反義寡核苷酸及RRM2的反義cDNA能顯著減少可誘導(dǎo)系統(tǒng)中RRM2蛋白的表達，降低酶活性，抑制癌細胞生長，逆轉(zhuǎn)耐藥［21］。就在今年八月美國食品藥品管理局（FDA）批準美國國家癌癥研究院（NCI）可以對Lorus公司先導(dǎo)化合反義藥物－GTI－2040與羅氏的希羅達（Xeloda），即卡培他濱（Capecitabine）進行治療轉(zhuǎn)移性乳癌的Ⅱ期臨床試驗。這是FDA所批準由Lorus和NCI合作進行的第二項臨床試驗計劃。第一次的試驗計劃是將GTI－2040與阿糖胞苷合用治療急性髓性白血病，目前在美國還有一個關(guān)于GTI－2040治療腎臟癌的Ⅱ期臨床正在進行中。也有報道將RRM2抑制劑和siRNA技術(shù)結(jié)合起來對其進行體內(nèi)和體外抑制腫瘤細胞增殖的研究［22］。腫瘤組織尤其是高危和晚期患者RRM2高表達，可能會影響藥物治療效果，增加治療失敗的可能性。對高危和復(fù)發(fā)患者選擇抑制RRM2基因蛋白表達和RRM2酶活性的藥物，將有助于提高患者的治療效果。

目前腫瘤主要治療手段仍然是手術(shù)、放療和化療，雖然綜合治療較以往提高了患者的生存率，但有些腫瘤發(fā)現(xiàn)即為晚期，失去手術(shù)機會，放療及化療存在著盲目性，此外化療的耐藥也是臨床醫(yī)生及患者必須面臨的重要問題。近年來，隨著基因組學(xué)及分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，腫瘤基因靶向治療作為一個新型的治療策略，它具有準確錨釘腫瘤部位，在局部保持相對高濃度，對正常組織細胞作用較小的特點，已經(jīng)成為腫瘤治療的一個熱點。實驗證明在多種腫瘤細胞中RRM2的表達水平明顯高于正常細胞，它可用來預(yù)測某些腫瘤化療的療效，也可作為某些腫瘤的新型的診斷標志物及潛在的治療靶點。利用RRM2的siRNA、反義寡核苷酸和反義cDNA能夠抑制某些腫瘤中RRM2的表達，能夠抑制這些腫瘤細胞的生長逆轉(zhuǎn)某些化療藥的腫瘤耐藥性。我們有理由相信，通過對RRM2的深入研究將有助于在基因水平及分子水平上揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的機制，為腫瘤的治療提供一個新的策略。

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王兆永（1979－），碩士研究生，臨床醫(yī)師，主要研究方向肝膽腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究。

2013－02－27）

本刊來稿中參考文獻編寫存在的主要問題

1007－4287（2014）02－0341－04

＊通訊作者

本刊來稿中參考文獻的編寫存在以下主要問題，望作者在投稿時注意：①文獻不新：除了個別涉及到方法學(xué)的歷史文獻外，一般應(yīng)選擇與論文密切相關(guān)的近3～5年的文獻，其中綜述文章更應(yīng)有近1～2年的新文獻。在本刊來稿中，許多作者在寫論文之前，并沒有系統(tǒng)地查閱最新文獻，論文選題可能近幾年報道并不少，但引用的文獻卻多為10年以上的文獻，近5年的文獻很少，使論文的先進性受到很大影響。②所選參考文獻與本文關(guān)系不大：醫(yī)學(xué)論文引用的文獻應(yīng)該是與論文中的方法、結(jié)果和討論內(nèi)容密切相關(guān)，不可缺少的文獻，對于那些已是本學(xué)科常識性的內(nèi)容，不必再通過引用參考文獻來說明。有的來稿在討論中牽強地引用一些可有可無的文獻，有些甚至與本文沒有明顯的關(guān)系，使文章內(nèi)容不突出。③文獻編寫無規(guī)律：本刊參考文獻采用“順序編碼制”，即根據(jù)正文中引用參考文獻的先后順序，在文后用溫哥華格式編寫，并要求在內(nèi)文相應(yīng)的地方用上標的形式標出。在本刊來稿中，有一部分作者在文內(nèi)沒有標出參考文獻的引用位置，或參考文獻的著錄格式不對、著錄項目不全。④引用非正式發(fā)表的或尚未發(fā)表的文獻：一般來說，“會議資料”、“內(nèi)部資料”及“待發(fā)表”等文獻均不能算為正式的參考文獻，均不宜引用。