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清營瀉瘀方聯(lián)合力肽對腸缺血再灌注損傷大鼠腸屏障的保護作用

2014-01-22 06:12:30方孫陽吳志明
關(guān)鍵詞:內(nèi)毒素乳酸西藥

陳 江,方孫陽,吳志明

浙江紹興醫(yī)院普外科(紹興312030)

我們在臨床實踐發(fā)現(xiàn),腸缺血再灌注損傷急性期以熱邪和毒邪為主,表現(xiàn)為熱毒熾盛,采用清營瀉瘀方,清熱解毒,涼血瀉瘀,臨床應(yīng)用效果顯著。前期實驗發(fā)現(xiàn)[1],清營瀉瘀方與大承氣方相比,其對腸缺血再灌注損傷大鼠腸屏障有顯著的保護作用。本實驗以此為基點,研究清營瀉瘀方聯(lián)合力肽對腸缺血再灌注大鼠腸屏障的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠72只,體質(zhì)量(280±10)g,清潔級。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物公司提供。清潔級動物房飼養(yǎng),20~24℃,自由飲水,普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物 戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司。中藥清營瀉淤方:水牛角片30 g,益母草30 g,生大黃15 g(后下),芒硝12 g,黨參15 g,甘草10 g。中藥大承氣方:生大黃12 g(后下),厚樸24 g,枳實12 g,芒硝6 g(沖)。采用配方顆粒制成濃度為1∶1藥液(含生藥1 g/mL),滅菌處理后4℃冰箱內(nèi)保存。配方顆粒劑由江蘇天陰藥業(yè)有限公司提供。力肽由無錫華瑞制藥有限公司提供。

1.3 主要試劑及儀器 TNF-α和IL-10的試劑盒分由美國Biosouce International Inc和R&D Systems Inc公司提供。D-乳酸試劑盒為美國Synthecon公司產(chǎn)品,D-乳酸脫氫酶(D-LDH)購于美國Sigma公司。芬蘭Labsystems Dragon Wellscan MK2型酶標儀。

1.4 動物模型的制備 1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。上腹部正中切口(長約2 cm)入腹,分離腸系膜上動脈及其周圍組織,在腸系膜上動脈根部用動脈夾鉗夾,觀察2 min。待確定腸系膜上動脈血流被阻斷(腸壁蒼白,血管無搏動),縫合傷口。45 min后開腹,打開動脈夾,恢復(fù)腸系膜上動脈血液供應(yīng)(腸壁變紅,血管搏動),再關(guān)腹。整個手術(shù)過程中,腹腔內(nèi)滴加37℃生理鹽水5 mL,保持血流動力學(xué)的穩(wěn)定,并注意保暖。

1.5 動物分組及給藥方法 將72只大鼠隨機分為假手術(shù)組8只、模型組、中藥組(清營瀉瘀方)、西藥組(力肽)、合用組(清營瀉瘀方聯(lián)合力肽)各16只,后四組按造模后處死時間再分別分為再灌注后2 h組和再灌注后24 h組(每組8只)。術(shù)前2 d分別給予生理鹽水、清營瀉瘀方和力肽灌胃(2.2 mL/只/d),最后1 d灌胃在術(shù)前30 min。按組別分于再灌注后2 h和24 h處死,取末端回腸組織作病理切片;所采血樣3000 r,離心20 min,分離血清和血漿,置-70℃超低溫冰箱中保存。

1.6 檢測指標及其方法 組織病理學(xué):將回腸末端組織固定于中性福爾馬林溶液中,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片HE染色后光鏡下觀察組織學(xué)變化。血清中TNF-α和IL-10的測定采用酶標儀進行測定,按照試劑盒使用說明所規(guī)定的操作規(guī)程和結(jié)果判定方法進行。血漿D-乳酸采用改良的酶學(xué)分光光度法檢測。將血漿加入試管,與含4.6 mmol/L NAD+的碳酸鹽緩沖液混合。待測管加入50μL D-乳酸脫氫酶,空白管加入50μL蒸餾水,以空白管調(diào)零于340 nm處測定吸光度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以以均數(shù)±標準差(x±s)表示,組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察 腸黏膜病理采用Chiu評分,評分標準見表1,結(jié)果見表2。光鏡下,假手術(shù)組回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯變化(圖1);模型組腸I/R后2 h后呈急性炎癥改變:黏膜和黏膜下層充血、水腫和糜爛,固有層有多量中性粒細胞浸潤,部分可見黏膜上皮壞死脫落(圖2);中藥組和西藥組亦可見上述表現(xiàn),但損傷程度較模型組明顯減輕(P<0.01),合用組優(yōu)于中藥組(P<0.05)(圖3~圖5)。腸I/R后24 h,各組腸黏膜結(jié)構(gòu)基本修復(fù),治療組與模型組無明顯差別(P>0.05)。

表1 腸黏膜損傷評分標準

表2 各組間大鼠腸黏膜Chiu評分(±s)

表2 各組間大鼠腸黏膜Chiu評分(±s)

注:與假手術(shù)組比較,a P<0.05,aa P<0.01;與模型組比較,b P<0.05,bb P<0.01;與西藥組比較,c P<0.05,cc P<0.01與中藥組比較,d P<0.05,dd P<0.01

組別假手術(shù)組模型組西藥組中藥組合用組n8 8 8 8 8再灌注2 h 0.63±0.52bb、cc、dd 4.13±0.83aa、cc、dd 3.25±0.46aa、bb、dd 2.38±0.52aa、bb、cc 1.63±0.52aa、bb、cc、d再灌注24 h 0.63±0.52bb、cc、dd 2.13±0.64aa 2.00±0.76aa 1.75±0.71aa 1.50±0.53a

2.2 血清TNF-α和IL-10含量變化 腸I/R后2 h,與假手術(shù)組相比,模型組血清中TNF-α水平明顯升高(P<0.01);中藥組和合用組TNF-α水平均較模型組明顯降低(P<0.01);IL-10的表達在各組間無差別。腸I/R后24 h,與假手術(shù)組相比,模型組血清中TNF-α和IL-10水平均明顯升高(P<0.01);中藥組和合用組TNF-α水平較模型組降低;中藥組和合用組IL-10水平均較模型組明顯降低(P<0.01)見表3。

圖1 假手術(shù)組(HE,×40)

圖2 模型組腸I/R后2 h(HE,×40)

圖3 中藥組腸I/R后2 h(HE,×40)

圖4 西藥組腸I/R后2 h(HE,×40)

圖5 合用組腸I/R后2 h(HE,×40)

2.3 血漿中D-乳酸含量的變化 腸I/R后2 h,與假手術(shù)組相比,模型組血漿中D-乳酸水平明顯升高(P<0.01);中藥和西藥組D-乳酸水平較模型組均明顯降低(P<0.01),中藥組優(yōu)于西藥組(P<0.05).腸I/R后24 h,與假手術(shù)組相比,模型組血漿中D-乳酸水平明顯升高(P<0.01);中藥組D-乳酸水平較模型組降低(P<0.05)見表4。

3 討論

中醫(yī)認為,邪和瘀是諸血管病發(fā)生的主要原因,以邪為主因,由邪(致病因子)致瘀(血栓),繼而傷正(缺血或郁血)。因此,邪盛致生新瘀則病急,邪祛但留舊瘀則病緩。盡管活血化瘀類中藥如丹參等具有改善腹腔臟器的血液循環(huán),防止血栓形成的作用,但是僅適用于慢性缺血階段,如果不擇時機,不辨病邪的全程重用,反可使療效降低,病程延長。我們在臨床實踐發(fā)現(xiàn),腸缺血再灌注損傷急性期以熱邪和毒邪為主,表現(xiàn)為熱毒熾盛,灼傷營血而生瘀,治療上以清熱解毒,涼血瀉瘀為主,療效顯著。

表3 各組間大鼠血清TNF-α和IL-10含量比較(±s D,pg/mL)

表3 各組間大鼠血清TNF-α和IL-10含量比較(±s D,pg/mL)

注:與假手術(shù)組比較,aa P<0.01;與模型組比較,b P<0.05,bb P<0.01;與西藥組比較,c P<0.05,cc P<0.01;與中藥組比較,d P<0.05,dd P<0.01

組別假手術(shù)組模型組西藥組中藥組合用組n 8 8 8 8 8 TNF-α IL-10再灌注2 h 90.77±4.41bb、dd 143.21±18.19aa、dd 115.86±18.27 104.17±6.40aa、bb 92.41±18.35bb再灌注24 h 90.77±4.41bb、dd 114.88±13.73aa、d 110.64±8.93aa 102.83±13.90b 94.16±10.60bb、cc再灌注2 h 16.14±4.22 19.93±6.40 16.46±4.89 17.35±2.89 16.29±4.67再灌注24 h 16.14±4.22bb、cc 49.04±13.17aa、c、dd 37.57±13.61aa、b、dd 22.83±8.31bb、cc 21.87±6.51bb、cc

表4 各組間大鼠血漿中D乳酸含量的比較(±s D:mg/L)

表4 各組間大鼠血漿中D乳酸含量的比較(±s D:mg/L)

注:與假手術(shù)組比較,aa P<0.01;與模型組比較,b P<0.05,bb P<0.01;與西藥組比較,c P<0.05,cc P<0.01;與中藥組比較,d P<0.05,dd P<0.01

組別假手術(shù)組模型組西藥組中藥組合用組n8 8 8 8 8再灌注2 h 3.60±0.69bb、cc、dd 14.13±2.09aa、cc、dd 11.84±1.42aa、bb、d 10.38±1.41aa、bb、c 8.69±0.92aa、bb、cc、d再灌注24 h 3.60±0.69bb、cc、dd 9.93±1.03aa、c、dd 8.94±0.74aa、b 8.54±0.54aa、bb 7.49±0.67aa、bb、cc、dd

清營瀉瘀方是上海市名老中醫(yī)奚九一教授的臨床經(jīng)驗方劑,重用益母草、水牛角片作為清熱涼血解毒之主藥,具有清熱解毒、涼血行瘀、利水消腫的功效。此外根據(jù)“六腑以通為用”,“胃氣以降為順”的原則,還著重使用了通腑瀉下類藥物大黃和芒硝,蕩滌腸胃宿垢、致病菌和毒素,消除腸道麻痹造成的腸道瘀滯狀態(tài),使病人在最短的時間內(nèi)排便、排氣,減少腸道有害物質(zhì)的吸收,減少腸道細菌移位。同時能夠通過調(diào)節(jié)前列腺素I2(PGI2)與血栓素B2(TXB2)之間的平衡,保證組織器官的微循環(huán),改善腸道組織血液灌流,降低毛細血管的通透性,維護腸道黏膜屏障的正常功能,從而降低血中內(nèi)毒素水平,預(yù)防MODS的發(fā)生。其中大黃為必用藥物,近來研究證明,大黃對胃腸黏膜有明顯保護的作用[2]。它可提高膿毒癥患者胃腸黏膜內(nèi)pH值,改善胃腸道血流灌注,緩解胃腸黏膜缺血缺氧。動物實驗也表明,其可促進胃腸黏膜內(nèi)杯狀細胞增生,清除氧自由基,抑制細菌移位。內(nèi)毒素休克大鼠給予大黃治療可明顯降低內(nèi)毒素所致胃腸道微血管通透性,抑制腸道內(nèi)毒素吸收,機制可能與大黃抑制內(nèi)毒素休克大鼠血漿和腸壁血小板活化因子及磷脂酶A2(PLA2)的生成有關(guān)。近年來,研究還發(fā)現(xiàn),腸缺血再灌注損傷過程中,大黃能提高缺血再灌注損傷腸道熱休克蛋白(HSP70)表達[3]。HSP70有免疫調(diào)節(jié)、炎癥調(diào)節(jié)、抗氧化、抗細胞凋亡及改善組織代謝等作用。Singleton KD等[4]發(fā)現(xiàn),使用熱休克因子表達抑制劑槲皮素等來阻止HSPs的表達后,谷氨酰胺介導(dǎo)的保護腸道,促進腸功能恢復(fù)的作用則大大減弱??梢姶簏S對腸道的保護作用與多種機制相關(guān)。

TNF-α作為促炎介質(zhì)中的首動因子及致炎損傷網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié),在腸缺血再灌注損傷中起著重要的作用,它可誘發(fā)IL-1、IL-6、IL-8、血小板活化因子(PAF)、前列腺素和白三烯等的分泌,由此產(chǎn)生炎癥連鎖反應(yīng),引起全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征。IL-10是一種有效的抗炎介質(zhì),可拮抗TNF-α,產(chǎn)生保護作用,但產(chǎn)生過多可引起免疫抑制。李文雄等[5]對32例膿毒癥患者進行研究,檢測其血清TNF-α、IL-10濃度并計算IL-10/TNF-α比值,發(fā)現(xiàn)血清IL-10水平或IL-10/TNF-α比值高的膿毒癥患者,預(yù)后差。我們的研究表明,清營瀉瘀方聯(lián)合力肽在腸I/R早期能夠降低大鼠血清促炎介質(zhì)TNF-α的表達水平,晚期能夠降低抗炎介質(zhì)IL-10的表達水平,阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng),提高機體的免疫功能。

D-乳酸是腸道固有細菌的代謝終產(chǎn)物,由于其他哺乳動物機體各組織既不能產(chǎn)生D-乳酸也沒有快速代謝分解D-乳酸的酶系統(tǒng),所以外周血D-乳酸主要來源于腸道,而其在肝內(nèi)不被分解,故其水平可反映腸道機械屏障的功能狀態(tài)。大多研究[6-7]表明,急性腸缺血引起的腸黏膜損傷可使血D-乳酸濃度迅速升高,并且D-乳酸含量與內(nèi)毒素濃度呈顯著正相關(guān)。清營瀉瘀方通過蕩滌腸胃宿垢、致病菌和毒素,降低炎癥介質(zhì)的含量而消除腸道瘀滯狀態(tài),減少腸道有害物質(zhì)的吸收,減少腸道細菌移位,保護腸屏障功能,減少腸道細菌和內(nèi)毒素移位。

腸缺血再灌注損傷是多種因素參與的復(fù)雜病理過程,而目前單一的藥物治療往往無法奏效,所以只有全面考慮,盡可能地打斷多種環(huán)節(jié)的影響,才有可能取得突破性的進展。中西醫(yī)結(jié)合保護腸I/R損傷有著很大的發(fā)展空間,但其應(yīng)用方式、劑量、副作用及長期療效尚不肯定,缺乏嚴謹?shù)呐R床實驗設(shè)計及大樣本的對比研究,值得做進一步研究。我們應(yīng)針對腸道缺血再灌注損傷的發(fā)病機制,對中西藥物結(jié)合的藥理作用做更進一步的研究,在臨床方面進行較大規(guī)模的前瞻、多中心研究,采用循證醫(yī)學(xué)的方法對中西醫(yī)結(jié)合保護腸缺血再灌注方面的最終療效進行客觀的評價,并進一步研制開發(fā)出更為有效的藥物,從而為早期防治創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS的研究開辟新的途徑。

[1]吳志明,陳江,儲修峰,等.清營瀉瘀方對腸缺血再灌注損傷大鼠的保護作用及機制[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2010,(16)5:557-560.

[2]陳德昌,楊興易,景炳文,等.大黃對危重病患者多器官功能衰竭綜合征的防治研究[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2004,13(2):103-106.

[3]孫家艷,朱海蓉,談定玉.大黃對腸缺血再灌注大鼠腸黏膜和通透性的影響及其機制[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2008,13(4):392-395.

[4]Singleton KD,Serkova NP,Beckey VE,et al.Glutamine attenu?ates lung injury and improves survival after sepsis:Role of en?hanced heat shock protein expression[J].Crit Care Med,2005,33(6):1206-1213.

[5]李文雄,陳惠德,王小文,等.膿毒癥患者血清TNFα、IL-10水平、IL-10/TNFα比值的變化及其臨床意義[J].中華普通外科雜志,2003,18(4):229-231.

[6]柳勒龍,田曉峰,張雪梅,等.D-乳酸在急性腸缺血早期診斷中的價值[J].中華實驗外科雜志,2004,(21)4:497-450.

[7]吳彪,王春友.急性胰腺炎腸道屏障功能損傷時血漿內(nèi)毒素和D2乳酸的變化[J].中華普通外科雜志,2009,18(3):224-227.

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