石園園 綜述 楊向群 審校

·綜述·

脂肪源性干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究進(jìn)展

石園園 綜述 楊向群 審校

脂肪源性干細(xì)胞因具有生物學(xué)特性穩(wěn)定、來源廣泛、取材方便、數(shù)量充足、易于培養(yǎng)擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，且在特定的誘導(dǎo)條件下可以分化為心肌細(xì)胞，有望成為細(xì)胞治療的理想來源。誘導(dǎo)方法的選擇，影響分化因素的研究已成為了細(xì)胞治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本文就脂肪源性干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法和機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

脂肪源性干細(xì)胞誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化

2001年，Zuk等[1]首次從脂肪組織中成功分離出脂肪源性干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ASCs），發(fā)現(xiàn)其具有多向分化潛能，在特異性誘導(dǎo)因子的作用下，可以向特定類型的細(xì)胞分化[2]。隨后，Rangappa等[3]首次證實(shí)了腹部皮下白色脂肪的ASCs在5-氮胞苷（5-azacytidine，5-AZA）的誘導(dǎo)下可向心肌細(xì)胞分化。心肌細(xì)胞的再生能力低下，不能夠有效補(bǔ)充大面積心肌梗死所造成的心肌細(xì)胞丟失，致使梗死部位瘢痕形成及心肌收縮力降低和電傳導(dǎo)系統(tǒng)改變。近年來，細(xì)胞治療已經(jīng)作為一種新的療法被應(yīng)用于心肌梗死后的修復(fù)。研究表明，植入心肌損傷模型的ASCs可能通過在梗死區(qū)分化為大量心肌細(xì)胞，或旁分泌方式刺激血管新生等機(jī)制來改善心肌的功能[4]。相比于其他干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等，ASCs具有生物學(xué)特性穩(wěn)定、來源廣泛、取材方便、數(shù)量充足且易于培養(yǎng)擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，有望成為細(xì)胞治療的理想來源[5]。誘導(dǎo)ASCs向心肌細(xì)胞定向分化已成為細(xì)胞治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。現(xiàn)就ASCs向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法和機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 體外誘導(dǎo)ASCs向心肌細(xì)胞分化的方法及機(jī)制

1.1 5-AZA誘導(dǎo)法

繼1999年Makino等[6]首次將5-AZA應(yīng)用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cell,BMSCs）向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化之后，5-AZA被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)多種細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，包括胚胎干細(xì)胞、P19細(xì)胞以及ASCs等。5-AZA是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。DNA的甲基化與基因的表達(dá)、染色體的修飾和失活、基因組印跡和內(nèi)源性的基因沉默相關(guān)[7]。干細(xì)胞多能性及自我更新能力的保持也與DNA的甲基化密切相關(guān)。與細(xì)胞分化相關(guān)的基因在低甲基化時(shí)被激活，高甲基化時(shí)被抑制[8]。5-AZA有可能通過去甲基化作用激活A(yù)SCs對(duì)α-重鏈肌球蛋白、β-重鏈肌球蛋白、肌鈣蛋白、GATA-4、肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC-2v）、連接蛋白43及心鈉素等心肌特異性基因的表達(dá)。

Rangappa等[3]使用免疫熒光檢測(cè)到了分化細(xì)胞對(duì)肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白及肌鈣蛋白I（Cardiac troponin T，cTnT）的表達(dá)，并認(rèn)為5-AZA會(huì)誘導(dǎo)ASCs進(jìn)入快速增殖的不穩(wěn)定狀態(tài)，一旦耗盡增殖潛能，這些瞬間增多的干細(xì)胞就會(huì)退出增殖周期，變成終末分化的心肌細(xì)胞，并轉(zhuǎn)變其端粒末端轉(zhuǎn)移酶基因。2005年，Strem等[9]使用相同的方法成功誘導(dǎo)了鼠腹股溝來源的ASCs向心肌細(xì)胞的分化，并通過RT-PCR分析顯示出了分化細(xì)胞對(duì)MLC-2v、GATA-4、α-重鏈肌球蛋白及β-重鏈肌球蛋白等心肌特異性標(biāo)志表達(dá)的上調(diào)。Carvalho等[10]在所有的分化細(xì)胞中均檢測(cè)到了橫紋肌肌動(dòng)蛋白和連接蛋白43的表達(dá)。

雖然在很多的研究中5-AZA都成功誘導(dǎo)了ASCs向心肌細(xì)胞的分化，但是這些ASCs大多是鼠或兔來源的，在對(duì)hASCs誘導(dǎo)分化的研究中，5-AZA的誘導(dǎo)作用是存在爭(zhēng)議的。Lee等[11]使用5-AZA誘導(dǎo)處理人腹部皮下白色脂肪的ASCs，既沒有觀察到自主跳動(dòng)的細(xì)胞，也沒有檢測(cè)到心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志的表達(dá)，認(rèn)為單純的5-AZA不足以誘導(dǎo)hASCs向心肌細(xì)胞的分化。2010年，Choi等[12]報(bào)道5-AZA誘導(dǎo)hASCs向心肌細(xì)胞的分化具有傳代的限制性，僅在第4代hASCs分化來的細(xì)胞上檢測(cè)到了心肌特異性標(biāo)志Nkx2.5、肌鈣蛋白Ⅰ和α-輔肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。通過對(duì)ASCs啟動(dòng)子上的一段長(zhǎng)2.5 Kb區(qū)域的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大部分心肌特異性基因并沒有被甲基化，ASCs向心肌細(xì)胞分化的潛能并沒有被啟動(dòng)子的甲基化所阻斷，這些啟動(dòng)子并不直接被5-AZA的去甲基化影響。隨后，有研究報(bào)道，使用5-AZA誘導(dǎo)第5代和第10代的hASCs，也僅觀察到分化細(xì)胞形成肌管樣結(jié)構(gòu)，而且定量PCR分析顯示，分化細(xì)胞中大部分心源性基因的表達(dá)是下調(diào)的[13]。

此外，關(guān)于5-AZA的誘導(dǎo)條件也存在一定爭(zhēng)議。首先是5-AZA的使用濃度，Rangappa等[3]發(fā)現(xiàn)9 μmol/L的5-AZA誘導(dǎo)結(jié)果最佳；Martin-Rendon等[14]報(bào)道5 μmol/L或10 μmol/L的5-AZA誘導(dǎo)結(jié)果并沒有明顯差別；還有研究表明，3 μmol/L的5-AZA已經(jīng)足以誘導(dǎo)ASCs向心肌細(xì)胞的分化[15-16]。其次是誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)，大多研究支持24 h是最佳的誘導(dǎo)時(shí)間[3，11，14]。增加誘導(dǎo)處理時(shí)間并不能提高ASCs向心肌細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)化率，過長(zhǎng)或反復(fù)誘導(dǎo)則可能會(huì)增強(qiáng)5-AZA對(duì)細(xì)胞的遺傳毒性，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[9，12]。

1.2 心肌細(xì)胞提取液誘導(dǎo)法

研究發(fā)現(xiàn)，在體外，一種成體細(xì)胞的提取液可能通過促進(jìn)細(xì)胞核攝入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和誘導(dǎo)染色體重建等機(jī)制，改變另一種細(xì)胞的分化方向[17-18]。2004年，Gaustad等[19]使用大鼠心肌細(xì)胞質(zhì)核提取液，成功地誘導(dǎo)了第4代hASCs向心肌細(xì)胞分化，免疫熒光檢測(cè)到部分分化細(xì)胞橫紋肌肌動(dòng)蛋白、縫隙連接蛋白43等心肌特異性標(biāo)志的表達(dá)。該研究認(rèn)為，ASCs可能通過攝取提取液中的分化因子，改變了核內(nèi)染色體的結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)被抑制基因的表達(dá)，但是在ASCs的表面并沒有檢測(cè)到相關(guān)的受體結(jié)構(gòu)。提取液加熱后對(duì)ASCs的誘導(dǎo)分化作用會(huì)消失，提示誘導(dǎo)作用可能和熱不穩(wěn)定蛋白相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，小的非編碼核RNA也可能與細(xì)胞的分化或基因的重組有關(guān)[20-21]。Perán等[22]使用人心房細(xì)胞的質(zhì)核提取液誘導(dǎo)hASCs，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組細(xì)胞的活性僅為對(duì)照組細(xì)胞的15%～20%，免疫印跡分析顯示，存活的分化細(xì)胞中有73%～80%都能表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志，包括橫紋肌肌動(dòng)蛋白、cTnT、cTnI、連接蛋白43及結(jié)蛋白等，并呈現(xiàn)出形態(tài)上的特征性變化，包括體積的增大、纖維樣變和雙核變等。RT-PCR檢測(cè)到的心肌相關(guān)性基因，也進(jìn)一步證實(shí)了免疫印跡分析的結(jié)果。

1.3 甲基纖維素培養(yǎng)基誘導(dǎo)法

2004年，Planat-Bénard等[23]首次證實(shí)了取自鼠腹股溝和肩胛部的ASCs可以自發(fā)地分化為心肌細(xì)胞。分化細(xì)胞間存在緊密連接，并形成了肌管樣結(jié)構(gòu)。GATA-4、Nkx2.5、心室和心房MLC-2v和MLC-2a等心源性基因及分泌物心房鈉尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）的檢測(cè)均為陽(yáng)性。相關(guān)的機(jī)制尚未清楚，但目前有許多研究認(rèn)為細(xì)胞因子和化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)這種分化具有促進(jìn)作用。Song等[24]發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）可能通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)這種分化。在培養(yǎng)基中添加VEGF可以顯著增加α-MHC、cTnI和Nkx2.5的表達(dá)，抗VEGF抗體則可以阻斷cTnT的表達(dá)。Palpant等[25]使用相似的培養(yǎng)基培養(yǎng)取自小鼠肩胛區(qū)的ASCs，也得到了一致的結(jié)果。蛋白質(zhì)印跡分析顯示出cTnI的蛋白質(zhì)亞型從慢骨骼肌肌鈣蛋白Ⅰ向成體心肌肌鈣蛋白Ⅰ的演變過程，進(jìn)一步證實(shí)了ASCs具有分化并發(fā)育為成熟心肌細(xì)胞的潛能。該研究還發(fā)現(xiàn)，重組Wnt蛋白也可通過影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，來促進(jìn)ASCs向心肌細(xì)胞的分化。但有研究認(rèn)為，這些結(jié)果可能只是由于心肌蛋白的被動(dòng)吸收或外源性因子誘導(dǎo)的暫時(shí)性轉(zhuǎn)錄，而非ASCs的真正分化[11]。

1.4 與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)法

2010年，Choi等[12]分別使用直接接觸共培養(yǎng)法和間接接觸共培養(yǎng)法，來培養(yǎng)hASCs和新生鼠的心肌細(xì)胞。直接接觸共培養(yǎng)法成功誘導(dǎo)了hASCs向心肌細(xì)胞的分化，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分化細(xì)胞對(duì)人心肌肌動(dòng)蛋白mRNA的表達(dá)具有時(shí)間依賴性。間接接觸培養(yǎng)組卻沒有檢測(cè)到人心肌肌動(dòng)蛋白mRNA水平的顯著變化。該研究認(rèn)為，細(xì)胞的直接接觸是誘導(dǎo)ASCs分化的關(guān)鍵，可能存在3種機(jī)制：①鄰近的鼠心肌細(xì)胞的機(jī)械性伸長(zhǎng)；②通過細(xì)胞膜接觸的潛在性的電信號(hào)傳導(dǎo)；③融合因子通過縫隙連接從鼠心肌細(xì)胞傳遞至ASCs。同年，Jin等[26]將鼠ASCs與新生鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行間接接觸培養(yǎng)，得出了相同的結(jié)果。但在加入淫羊藿甙（Icaria，ICA）的間接接觸培養(yǎng)組，卻檢測(cè)到了分化細(xì)胞對(duì)心肌特異性基因，包括轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA-4、MLC-2v、α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白和cTnT等的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，ICA可通過信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化進(jìn)行調(diào)節(jié)[27-31]。EPK的抑制劑PD98059可以部分抑制ICA的誘導(dǎo)作用。對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用可能是其介導(dǎo)分化的關(guān)鍵所在，但并不是唯一的作用機(jī)制，腫瘤抑制基因也可能與之相關(guān)。隨后，Cai等[32]的研究再次證實(shí)了直接接觸共培養(yǎng)法誘導(dǎo)ASCs向心肌細(xì)胞分化的作用。該研究還發(fā)現(xiàn)，移植前在體外進(jìn)行ASCs與心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)處理可以提高體內(nèi)分化細(xì)胞的cTnT表達(dá)陽(yáng)性率。Behfar等[33]的報(bào)道同樣表明，在慢性心肌損傷模型上移植經(jīng)共培養(yǎng)處理過的ASCs，對(duì)心肌功能和結(jié)構(gòu)的改善都要優(yōu)于直接注射自然狀態(tài)下的ASCs。雖然其中的機(jī)制仍不清楚，但是與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)可以形成一個(gè)相似于心臟的微環(huán)境，心肌細(xì)胞也可以通過分泌細(xì)胞因子、激素或一些可溶性因子調(diào)節(jié)信號(hào)通路從而誘導(dǎo)ASCs向心肌細(xì)胞的分化。

2 分化細(xì)胞的收縮或自主搏動(dòng)現(xiàn)象

在一些誘導(dǎo)ASCs向心肌細(xì)胞分化的研究中，不僅檢測(cè)到了心肌特異性標(biāo)志的表達(dá)，還觀察到了分化細(xì)胞的收縮活動(dòng)或自主搏動(dòng)現(xiàn)象。這種現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制尚未研究清楚，但可能與誘導(dǎo)方法的選擇或ASCs的組織來源相關(guān)。研究表明，上述誘導(dǎo)方法均有可能誘導(dǎo)ASCs分化為收縮或自主搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。但同一種方法中誘導(dǎo)物濃度或誘導(dǎo)時(shí)間的差異可能導(dǎo)致結(jié)果的不同。在5-AZA誘導(dǎo)法中，僅有Rangappa等[3]在培養(yǎng)的第3周觀察到了分化細(xì)胞的自主搏動(dòng)，實(shí)驗(yàn)過程中用到的是9 μmol/L的5-AZA，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)24 h。Gaustad等[19]使用4～6周齡的大鼠心肌細(xì)胞提取液，成功誘導(dǎo)了hASCs向自主搏動(dòng)的心肌細(xì)胞分化。其他使用人心肌細(xì)胞提取液或新生鼠細(xì)胞提取液的研究中，均沒有觀察到收縮或自主搏動(dòng)現(xiàn)象。甲基纖維素培養(yǎng)基法誘導(dǎo)的分化細(xì)胞均發(fā)生了收縮[23-25]。Choi等[12]的研究中使用hASCs與新生鼠心肌細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)法，誘導(dǎo)的分化細(xì)胞也發(fā)生了自主搏動(dòng)。脂肪組織分為棕色脂肪和白色脂肪，動(dòng)物肩胛區(qū)和腹股溝處的脂肪組織中均含有棕色脂肪成分。有研究報(bào)道，棕色脂肪來源的ASCs具有較高的成心肌分化能力，且可在體外自發(fā)分化為有功能的心肌細(xì)胞[34]。上述甲基纖維素培養(yǎng)基法誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中的ASCs均來源于小鼠的腹股溝和肩胛部位，而另外三種方法中分化為能自主搏動(dòng)心肌細(xì)胞的ASCs均來自于白色脂肪組織。此外，Choi等[12]還認(rèn)為，分化細(xì)胞的收縮能力取決于接種細(xì)胞的密度，當(dāng)細(xì)胞密度小于5×104時(shí)，細(xì)胞間距過大，可導(dǎo)致細(xì)胞不能收縮。

關(guān)于自主搏動(dòng)的分化細(xì)胞是否是起搏細(xì)胞也需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。從起搏細(xì)胞的定義出發(fā)，這些分化細(xì)胞能夠自動(dòng)產(chǎn)生節(jié)律性興奮，發(fā)生自主搏動(dòng)，就應(yīng)該是起搏細(xì)胞。Planat-Bénard等[23]對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的分析，認(rèn)為這些分化細(xì)胞有可能是心室肌細(xì)胞（MLC-2a和連接蛋白43陽(yáng)性）、心房肌細(xì)胞（MCL-2a、ANP和連接蛋白40陽(yáng)性）及起搏細(xì)胞（介導(dǎo)自主收縮）的混合。該研究通過電流鉗檢測(cè)到了細(xì)胞的自發(fā)膜電位變化，藥物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分化細(xì)胞可以對(duì)腎上腺素能和膽堿能藥物作出相適應(yīng)的反應(yīng)，這些證據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了起搏細(xì)胞的存在。Palpant等[25]使用指示劑FURA2AM處理分化細(xì)胞，檢測(cè)到了與細(xì)胞收縮相一致的鈣瞬變。Choi等[12]也同樣檢測(cè)到了鈣瞬變，并發(fā)現(xiàn)分化細(xì)胞的鈣瞬變和收縮節(jié)律與周圍的大鼠心肌細(xì)胞相一致。該研究還通過細(xì)胞標(biāo)記的方法，證實(shí)了分化細(xì)胞與鼠心肌細(xì)胞間縫隙連接的存在?？p隙連接允許心肌細(xì)胞間的電偶聯(lián)，形成細(xì)胞間電興奮波（同步收縮的基礎(chǔ)）的傳導(dǎo)通路[35]，來自收縮的鼠心肌細(xì)胞的電刺激可能在誘導(dǎo)ASCs向心肌細(xì)胞分化的過程中起到了重要作用。

3 問題和展望

隨著人們對(duì)ASCs生物學(xué)特性認(rèn)識(shí)的加深，以及生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，ASCs在未來干細(xì)胞治療中的臨床應(yīng)用將具備無限可能。但是，現(xiàn)階段ASCs的誘導(dǎo)方法還存在很大的缺陷，幾乎所有的誘導(dǎo)結(jié)果都存在著低轉(zhuǎn)化率的問題；在共培養(yǎng)誘導(dǎo)法中，異種細(xì)胞間會(huì)存在免疫排斥作用，應(yīng)用到臨床上時(shí)將會(huì)需要大量的自體心肌細(xì)胞，而這對(duì)于經(jīng)歷過心衰的患者幾乎是不可能的。誘導(dǎo)和分化的機(jī)制也待更深層次的研究和探討，使用心肌細(xì)胞提取液或甲基纖維素培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)誘導(dǎo)物的最終去向，以及分化細(xì)胞的功能是否持久及其持續(xù)時(shí)長(zhǎng)都不清楚。分化細(xì)胞起搏特性的驗(yàn)證，也將會(huì)對(duì)生物起搏器的研制產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

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Differentiation of Adipose-derived Stem Cells into Cardiomyocytes

SHI Yuanyuan1,YANG Xiangqun2.

1 Company 2 of Clinical Medicine;Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;2 Department of Human Anatomy, Research Center of Regenerative Medicine,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.Corresponding author:YANG Xiangqun(E-mail:yangxgq@smmu.edu.cn).

【Summary】The use of stem cells in the treatment of myocardial infarct has been strongly pursued in recent years.Due to their availability,feasibility,plasticity,and their potential to differentiate into cardiomyocytes at specific media,adiposederived stem cells(ASCs)have become an ideal source of donor cells.A significant effort has gone into elucidating which factors and techniques influence this differentiation.The methods and mechanisms of differentiation of ASCs into cardiomyocytes were reviewed in this paper.

Adult mesenchymal stem cells;Induction;Cardiomyocytes;Differentiation

Q813.1+1

B

1673－0364（2014）06－0351－04

2014年3月16日；

2014年5月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.014

國(guó)家自然科學(xué)基金（31170934）。

200433上海市第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅學(xué)員二隊(duì)（石園園）；第二軍醫(yī)大學(xué)解剖學(xué)教研室、再生醫(yī)學(xué)研究中心（楊向群）。

楊向群（E-mail：yangxq@smmu.edu.cn）。