■陳姣姣 來(lái)航線 馬軍妮 薛泉宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌712100)

隨著我國(guó)畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的發(fā)展，飼料原料匱乏及成本不斷增加已成為制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。我國(guó)是蘋果生產(chǎn)大國(guó)，每年因蘋果汁加工產(chǎn)生蘋果渣300多萬(wàn)噸。利用蘋果渣作飼料可以有效解決飼料原料不足，但蘋果渣中蛋白質(zhì)、脂肪含量低，蘋果酸、單寧、果膠及其他碳水化合物含量高，直接飼喂易引起胃內(nèi)酸度過(guò)大，造成腸道微生態(tài)平衡失調(diào)，影響攝食量和消化利用率[1]。通過(guò)發(fā)酵提高發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量可以改善發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。近年國(guó)內(nèi)研究者對(duì)蘋果渣發(fā)酵工藝進(jìn)行了較多研究，但重點(diǎn)集中在發(fā)酵對(duì)飼料蛋白質(zhì)含量的影響[2-3]，對(duì)發(fā)酵引起的氨基酸含量及種類變化關(guān)注不多，影響了對(duì)蘋果渣發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)。本文重點(diǎn)研究發(fā)酵劑及玉米漿對(duì)蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸種類及含量的影響，旨在為蘋果渣發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種及復(fù)合發(fā)酵劑

黑曲霉 UA8（Aspergillas niger）、白地霉 B1410（Geotrichum candidum）及酵母菌（Yeast）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室提供。

發(fā)酵劑：2種復(fù)合發(fā)酵劑分別為白地霉+黑曲霉（Geotrichum candidum+Aspergillus niger，縮寫為GcAn）及酵母菌+黑曲霉(Yeast+Aspergillus niger，縮寫為YAn)組合。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：黑曲霉UA8活化及孢子懸液制備為PDA固體培養(yǎng)基及麩皮培養(yǎng)基；白地霉B1410、酵母菌活化及液體菌種制備用PDA固體培養(yǎng)基及PDA液體培養(yǎng)基，參考程麗娟等方法[4]。

蘋果渣固態(tài)發(fā)酵原料：烘干蘋果渣由眉縣恒興果汁有限公司提供。玉米漿由商惠酒精有限公司提供。尿素從市場(chǎng)購(gòu)買。原料A按蘋果渣∶尿素=19∶1的質(zhì)量比配制；原料B按蘋果渣∶玉米漿干粉∶尿素=17∶2∶1的質(zhì)量比配制。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

黑曲霉UA8孢子懸液制備采用賀克勇法[5]，白地霉B1410及酵母菌懸液制備采用任雅萍法[6]。血球計(jì)數(shù)法測(cè)得UA8孢子懸液、B1410及酵母菌懸液濃度分別4.32×108、4.09×108和4.50×108cfu/ml。將上述UA8孢子懸液與B1410細(xì)胞懸液及UA8孢子懸液與酵母菌懸液分別按1∶1體積比混合，組成兩種復(fù)合發(fā)酵劑菌懸液。

1.2.2 方案

試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：原料A+GcAn，原料B+GcAn，原料A+YAn，原料B+YAn，每處理重復(fù)3次。以未發(fā)酵蘋果渣原料為對(duì)照組（CK）。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵

稱取A、B發(fā)酵原料各50.0 g裝入650 ml組培瓶中，按干原料∶水=1∶2加100 ml自來(lái)水，不滅菌；按1.2.2方案分別接入復(fù)合發(fā)酵劑GcAn或YAn復(fù)合懸液6 ml，充分混勻，28℃培養(yǎng)72 h，40℃烘干，粉碎過(guò)篩備用。

1.2.4 氨基酸含量測(cè)定

發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸總量測(cè)定：稱取1.2.3過(guò)程制備的發(fā)酵產(chǎn)物1.000 g放入水解管中，加6 mol/l鹽酸10 ml，3～4滴新蒸餾苯酚，110 ℃水解22 h，冷卻、過(guò)濾、定容。吸取濾液1 ml于5 ml容量瓶，40℃真空干燥，殘留物用1 ml去離子水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次，最后蒸干，用1 ml pH值2.2的緩沖液溶解備用。

水溶性氨基酸測(cè)定：稱取1.2.3過(guò)程制備樣品1.500 g于小三角瓶中，加5%三氯乙酸50 ml，加蓋小漏斗在水浴鍋上沸浴，維持15 min，充分搖勻過(guò)濾，收集濾液備用。

以上樣品中氨基酸含量均用L-8900氨基酸分析儀測(cè)定。

1.2.5 結(jié)果計(jì)算

氨基酸發(fā)酵增率（⊿f）、玉米漿氨基酸增率（⊿B）采用下式計(jì)算：

式中

：Cck——未發(fā)酵蘋果渣氨基酸總量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg);

Cf——原料發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg)；

CA——原料A發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg);

CB——原料B發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量(g/kg)或水溶性氨基酸含量(mg/kg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量及影響因素

2.1.1 發(fā)酵劑(見表1)

由表1可知，接種復(fù)合發(fā)酵劑GcAn、YAn后其發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸含量大幅度增加。原料A發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸總量為49.48、66.54 g/kg；基本氨基酸含量為26.43、40.64 g/kg；必需氨基酸含量的增加幅度分別為34.9%～191.3%、46.3%～197.1%；基本氨基酸（除GcAn谷氨酸外）增幅分別為30.8%～95.4%、48.4%～125.2%。蛋氨酸分別增加191.3%、197.1%，精氨酸分別增加73.6%、102.9%。

表1 蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量

在原料B中，接種發(fā)酵劑GcAn、YAn發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸總量增加86.2%、83.2%，必需氨基酸增加78.2%、70.7%及基本氨基酸增加91.7%、92.0%，除谷氨酸、胱氨酸、丙氨酸及蛋氨酸外，其他氨基酸增率大致相同。由表中數(shù)據(jù)可知，在原料A中發(fā)酵劑YAn效果優(yōu)于GcAn，而在原料B中兩種發(fā)酵劑無(wú)明顯差異。

2.1.2 玉米漿(見表2)

從表2中的⊿B數(shù)值看出，在GcAn接菌處理中，加入玉米漿對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸總量影響較大。加玉米漿后，發(fā)酵產(chǎn)物的必需氨基酸增加11.8%～32.4%；除丙氨酸外，基本氨基酸增加11.0%～1 068.2%，其中谷氨酸含量較未加玉米漿對(duì)照組增加1 068.2%。在接種YAn處理中，加入玉米漿對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸總量影響不大，有5種必需氨基酸及3種基本氨基酸含量減少，其中蛋氨酸含量下降91.4%，其余氨基酸下降0.3%～4.5%。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明玉米漿對(duì)GcAn影響較大，而YAn不受其影響。

表2 玉米漿對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸總量的影響(⊿B，%)

2.2 水溶性氨基酸含量及影響因素

2.2.1 發(fā)酵劑(見表3)

從表3可知，蘋果渣經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后水溶性氨基酸種類變化很大。8種在蘋果渣原料中未檢出的氨基酸，有7種在發(fā)酵產(chǎn)物中檢出。在發(fā)酵后新增加的7種氨基酸中，3種必需氨基酸分別為異亮氨酸、蘇氨酸及蛋氨酸；4種基本氨基酸分別為丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸及絲氨酸。另外，與發(fā)酵原料蘋果渣相比，發(fā)酵后水溶性組氨酸消失。

表3 蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物水溶性氨基酸含量

在接種GcAn發(fā)酵劑時(shí)，原料A、B發(fā)酵產(chǎn)物的水溶性氨基酸總量較原料(對(duì)照組)分別增加181.5%、305.0%，水溶性必需氨基酸較原料對(duì)照分別增加518.6%、637.4%，水溶性基本氨基酸較原料對(duì)照組分別增加143.3%、267.3%，其中，基本氨基酸中的谷氨酸及必需氨基酸中的亮氨酸增幅最大，分別為1 535.1%、1 688.1%及1 447.8%、1 096.6%。接種YAn發(fā)酵劑時(shí)，原料A、B發(fā)酵產(chǎn)物中的水溶性氨基酸總量較原料(對(duì)照組)分別增加215.1%、272.0%，水溶性必需氨基酸量較原料對(duì)照組分別增加466.6%、675.4%，其中有7種(酪氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸)、10種氨基酸（丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸）含量低于GcAn接種處理。由此可知，除天門冬氨酸、脯氨酸和組氨酸外，2種發(fā)酵劑均可增加蘋果渣中所余14種水溶性氨基酸的含量，其中，水溶性谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸的含量增加尤為明顯。單從水溶性氨基酸含量的角度考慮，以原料A、B為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，接種GcAn復(fù)合發(fā)酵劑時(shí)效果較好。

2.2.2 玉米漿(見表4)

表4 玉米漿對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物水溶性氨基酸含量的影響(⊿B，%)

由表4可知，加入玉米漿后可使發(fā)酵產(chǎn)物中的水溶性氨基酸含量出現(xiàn)不同變化，而種類無(wú)變化。如接種YAn發(fā)酵劑時(shí)，水溶性必需氨基酸及水溶性基本氨基酸總含量均增加，除去5種末檢出氨基酸，其余12種氨基酸，8種水溶性氨基酸含量增加，其中4種必需氨基酸增加29.8%～75.0%；4種水溶性氨基酸含量減少，其中3種必需氨基酸減少6.3%～14.2%。在接種發(fā)酵劑GcAn時(shí)，也有類似趨勢(shì)。說(shuō)明玉米漿的加入使水溶性氨基酸總量略有增加，對(duì)各種水溶性氨基酸的含量影響不一，對(duì)水溶性氨基酸的種類無(wú)影響。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，采用2種復(fù)合發(fā)酵劑均能顯著提高蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸總量及水溶性氨基酸含量，增加某些水溶性氨基酸種類，改善蘋果渣發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。其中蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸及纈氨酸等動(dòng)物必需氨基酸或水溶性必需氨基酸含量增加對(duì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的改善意義更大。兩種發(fā)酵劑的發(fā)酵產(chǎn)物在氨基酸總量上無(wú)明顯差異。

本研究采用酵母、白地霉與黑曲霉組成的復(fù)合發(fā)酵劑對(duì)蘋果渣進(jìn)行混菌發(fā)酵。發(fā)酵劑中的黑曲霉主要用于產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶、糖化酶及等水解酶，將蘋果渣中的大分子碳水化合物水解為小分子糖類供酵母菌生長(zhǎng)，以合成單細(xì)胞蛋白；酵母菌及白地霉主要用于利用水解產(chǎn)生的小分子糖類及加入的尿素氮合成單細(xì)胞蛋白質(zhì)。即復(fù)合發(fā)酵劑利用黑曲霉與酵母菌或白地霉共同作用將底物中的非蛋白氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白。此外，黑曲霉還能合成蛋白酶，將蘋果渣中的植物性蛋白質(zhì)及發(fā)酵產(chǎn)物中的部分單細(xì)胞蛋白水解為氨基酸，增加水溶性氨基酸種類及含量。因此，發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基酸總量與微生物菌體的生長(zhǎng)及單細(xì)胞蛋白質(zhì)數(shù)量有關(guān)，其中的水溶性氨基酸含量與發(fā)酵產(chǎn)物中植物性蛋白質(zhì)及微生物蛋白質(zhì)水解有關(guān)。在不同的發(fā)酵劑組合中，水溶性氨基酸種類及含量差異很大，其含量取決于植物及菌體蛋白質(zhì)的酶解量與水解釋放的氨基酸被微生物利用的程度。

試驗(yàn)方案中向發(fā)酵原料中加入玉米漿的目的是改善發(fā)酵原料中微生物的營(yíng)養(yǎng)條件，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)繁殖，特別是提高產(chǎn)酶真菌生長(zhǎng)及胞外酶的合成與分泌，促進(jìn)對(duì)蘋果渣中大分子碳水化合物水解及單細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，提高發(fā)酵產(chǎn)物中單細(xì)胞蛋白數(shù)量、動(dòng)物必需氨基酸數(shù)量及水溶性氨基酸含量。玉米漿發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸總量及水溶性氨基酸總量在接種兩種發(fā)酵劑時(shí)均增加，其中接種白地霉+黑曲霉發(fā)酵劑時(shí)9種必需氨基酸總量的增幅達(dá)到11.8%～32.4%，即加入玉米漿對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)提高作用顯著，但也應(yīng)注意到，少數(shù)氨基酸含量減少。

蘋果渣發(fā)酵飼料的氨基酸含量雖有報(bào)道[7-8]，但對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的水溶性氨基酸變化缺乏研究，不同發(fā)酵劑及原料組成對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量的影響亦不清楚。本研究將為蘋果渣發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)提供較為系統(tǒng)的氨基酸資料。