■賴 穎 李青芝 馮盼盼 高 翔

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001）

鐵是人體及動物必需的微量元素，是血紅蛋白與肌紅蛋白、細胞色素A以及某些呼吸酶的組成成分，參與體內(nèi)氧與二氧化碳的轉(zhuǎn)運、交換和組織呼吸過程，并具有增強免疫的功能[1-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，約有30%的世界人口存在鐵缺乏現(xiàn)象，而90%的貧血現(xiàn)象是由于鐵缺乏所引起的[4]。食物中鐵的缺乏會引起貧血、免疫功能低下并誘發(fā)多種疾病，例如貧血性心臟病、舌炎、口角炎及各種感染性疾病和癌癥等[5]。無機態(tài)的鐵毒性較大，被機體吸收的水平很低。現(xiàn)存的普通口服鐵劑，由于鐵離子對胃腸道副作用大，因而限制了其使用[6]。研究低毒高效補鐵劑是目前鐵制劑開發(fā)的方向。

酵母菌具有富集多種微量元素的能力，其發(fā)酵工藝成熟，生產(chǎn)周期短，還可提供大量的菌體蛋白、氨基酸、豐富的B族維生素以及其他生物活性物質(zhì)，是目前作為微量元素載體理想的菌種[7-8]。富鐵酵母具有穩(wěn)定性好、吸收率高、安全性好，與食物中其他成分協(xié)同配合性好，具有良好的風(fēng)味等優(yōu)點，所以富鐵酵母作為強化食品的鐵源是預(yù)防鐵缺乏和缺鐵性貧血的一項行之有效的措施。

本研究利用酵母屬（Saccharomyces）中的發(fā)酵性接合酵母（Saccharomycescerevisiae）細胞能夠?qū)o機態(tài)的鐵轉(zhuǎn)化為有機形態(tài)的性質(zhì)，采用在酵母培養(yǎng)過程中添加Fe2+的方法制備富鐵酵母，并對影響酵母富鐵的因素進行了研究，從而確定酵母富鐵培養(yǎng)的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

發(fā)酵性接合酵母（Saccharomycescerevisiae）：7株，周口師范學(xué)院發(fā)酵工程實驗室提供，編號F-4、F-5、F-13、F-15、F-19、F-20、F-21。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、葡萄糖40，pH值自然；YPS培養(yǎng)基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、蔗糖40，pH值7.2；YPM培養(yǎng)基（g/l）：酵母粉10、蛋白胨10、麥芽糖40，pH值7.2；Wort培養(yǎng)基（g/l）：糖濃度為40 Birxe，pH值6.0；Mallases培養(yǎng)基（g/l）：蔗糖糖蜜 41、(NH4)2SO40.5、H3PO41.0，pH值自然；瓊脂斜面培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖40、MgSO45、K2HPO41、KH2PO41、蛋白胨10、瓊脂條20，pH值自然；平板篩選培養(yǎng)基（g/l）：瓊脂斜面培養(yǎng)基，150～200 mg/l鐵離子濃度，pH值自然；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖40、MgSO45、K2HPO41、KH2PO41、蛋白胨10，pH值自然。

1.1.3 儀器及試劑

儀器：AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；UV-5100型紫外/可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；JJ-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；DHP-9162型電子恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；PSM11R-090型pH計；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；ZH?WY-2102C型雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；HC-3018型高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有新公司）。

試劑：葡萄糖、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、鹽酸羥胺，試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物量的測定

取一定體積的發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，收集菌體，用蒸餾水洗滌酵母泥，離心，反復(fù)3次，收集菌體，置于干燥箱中60～80℃烘干至恒重，測定干細胞的重量，換算成1 L發(fā)酵液中含有的干細胞克數(shù)（g/l），即為細胞生物量。

1.2.2 鐵含量的測定

精確稱取0.2～0.3 g酵母干粉置于燒瓶中，加入濃硝酸∶高氯酸（4∶1）混合消化液5 ml置于電爐上，接上冷凝裝置，回流冷凝消化至樣液呈無色透明。冷卻后，用蒸溜水沖洗并轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，加水定容至刻度。然后準確吸取樣品溶液2 ml于50 ml試管中，之后操作按標準曲線繪制的方法進行，在相同的工作條件下，測定樣品溶液的吸光度，從標準曲線中查出鐵的含量。

鐵含量：每克干酵母吸附的鐵量（mg/g）；

生物量：每升培養(yǎng)液中含有的酵母干重（g/l）；

總鐵含量（mg/l）=細胞生物量（g/l）×細胞鐵含量（mg/g）。

1.2.3 菌種的選育

菌種的初篩：無菌條件下將23株初篩菌種接種至瓊脂斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h復(fù)蘇菌種，分別接一環(huán)菌種至100 ml種子培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h得種子液。然后進行發(fā)酵培養(yǎng)，種子液接種量10%、Fe2+濃度150 mg/l、28 ℃培養(yǎng)48 h，取一定量的發(fā)酵液離心，烘干，收集菌體分別測定其生物量和鐵含量。

菌種的復(fù)篩：從23株初篩菌株中篩選出7株總鐵含量較高的菌種，制成菌懸液后適當(dāng)稀釋，然后涂布于含鐵離子濃度200 mg/l的平板篩選培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3 d后從平板中選取大而圓的菌落進行復(fù)篩，測定菌體的生物量和鐵含量，從中篩選出1株總鐵含量最高的菌株。

1.2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

首先對影響菌株生長的碳源、氮源、Fe2+添加量、培養(yǎng)基裝液量、種子培養(yǎng)基接種量、培養(yǎng)時間、起始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、鐵添加時間、溫度等因素進行考察，測定菌株F-13在不同影響因素下的生物量及鐵含量；然后通過正交試驗對菌株生物量及鐵含量影響較大的因素水平進行進一步優(yōu)化，確定富鐵酵母F-13的最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種初篩和復(fù)篩

通過對23株不同種屬的酵母菌進行初篩，發(fā)現(xiàn)不同酵母菌株對硫酸亞鐵的抗性差異較大，不同菌株的生物量及鐵含量均不相同。從初篩菌株中篩選出7株總鐵含量較高的菌株進行復(fù)篩，結(jié)果見表1。菌株F-13鐵含量及總鐵含量均最高，故選擇菌株F-13作為本試驗的出發(fā)菌株。

表1 不同菌株細胞生物量及鐵含量的分析

2.2 富鐵酵母F-13發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 碳源對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

在含有Fe2+80 mg/l、糖濃度40 g/l、恒溫26 ℃、200 r/min的YPD、YPS、YPM、Wort和Mallases培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h。分別測定其生物量、細胞鐵含量，并計算細胞總鐵含量，結(jié)果如圖1所示，在以葡萄糖為碳源的YPD培養(yǎng)基中，菌株F-13細胞生物量稍低，但細胞鐵含量及總鐵含量最高，故選擇葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

學(xué)生作為教學(xué)中的接受方，具有一定的差異性，在應(yīng)用混合式教學(xué)的過程中，我們要尊重學(xué)生的個性，了解學(xué)生的共性，從而選擇合適的混合教學(xué)方式。首先，教師要重視學(xué)生的個性色彩，根據(jù)學(xué)生的基礎(chǔ)情況，選擇相應(yīng)的知識灌輸；另外，學(xué)生劃分多個學(xué)習(xí)小組，基礎(chǔ)相當(dāng)?shù)膶W(xué)生分到一個小組，根據(jù)小組自身學(xué)習(xí)的需要制定小組內(nèi)部的學(xué)習(xí)的方式、內(nèi)容和數(shù)量，充分發(fā)揮了學(xué)生的學(xué)習(xí)自主權(quán)。最后，不管是什么教學(xué)模式都要實現(xiàn)英語學(xué)習(xí)小組之間的溝通交流，主動參與網(wǎng)上互動，與教師在線互動，及時解決英語難題。所以，在實際的工作中我們不能不切實際脫離生活，英語教育內(nèi)容應(yīng)與日常生活息息相關(guān)，這樣的混合式教學(xué)活動才能得到想要的效果。

圖1 碳源對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

進一步研究了不同葡萄糖濃度對細胞生物量及鐵含量的影響，結(jié)果如圖2所示。在培養(yǎng)基葡萄糖濃度低于40 g/l時，隨著糖濃度的增大，菌株F-13的生物量呈緩慢上升趨勢，當(dāng)糖濃度大于60 g/l時，對其生長產(chǎn)生一定的抑制作用，生物量趨于穩(wěn)定。細胞鐵含量則隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度的增加呈下降趨勢，并在葡萄糖濃度達到60 g/l時趨于穩(wěn)定。綜合考慮細胞生物量及鐵含量，在葡萄糖濃度為40 g/l時細胞總鐵含量達到最高，因此，選取葡萄糖的濃度為40 g/l。

2.2.2 氮源對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的氮源（硝酸銨、牛肉膏、尿素、蛋白胨、酵母膏），根據(jù)微生物的生長需求，培養(yǎng)基的配制一般采用碳氮比為4∶1，結(jié)果見圖3。以蛋白胨為唯一氮源時，菌株F-13的細胞鐵含量和總鐵含量均高于其它氮源的細胞鐵含量和總鐵含量，故選擇蛋白胨為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖2 葡萄糖濃度對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

圖3 氮源對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

進一步研究不同蛋白胨濃度對細胞生物量及鐵含量的影響，結(jié)果(見圖4)表明，較高的蛋白胨濃度對細胞生物量及鐵含量均有一定的抑制作用，隨著蛋白胨濃度的繼續(xù)增加，細胞生物量及鐵含量均呈下降趨勢，在蛋白胨濃度為10 g/l時細胞鐵含量及生物量最高，故選擇蛋白胨濃度為10 g/l。

圖4 蛋白胨濃度對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

2.2.3 初始pH值對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究不同初始pH值下菌株生物量及鐵含量的富集情況。據(jù)圖5可知，pH值過低抑制菌株的生長且不利于菌株對鐵的吸收，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，酵母菌生長速度加快，細胞鐵含量增加，當(dāng)初始pH值大于6.0時酵母菌生長受到抑制，明顯表現(xiàn)為酵母菌顏色發(fā)生變化。Brady等的研究表明，微生物吸收金屬離子的最適pH值范圍是在4.0～8.0之間，因此確定本試驗的初始pH值為6.0。

圖5 初始pH值對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

2.2.4 鐵添加時間對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

在上述培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，為確定最佳鐵加入時間從而使酵母細胞獲得較高的總鐵含量。在不同發(fā)酵時間添加80 mg/l Fe2+，結(jié)果如圖6。在發(fā)酵0～10 h，細胞總鐵含量最高且基本趨于穩(wěn)定。因此，在開始發(fā)酵的同時即加入硫酸亞鐵。

圖6 鐵添加時間對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

2.2.5 裝液量對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

利用不同的裝液量來模擬不同的溶氧程度對菌株F-13生長的影響。分別用250 ml的三角瓶裝入不同體積的培養(yǎng)基，測定菌株的鐵含量和生物量，試驗結(jié)果如圖7所示。在250 ml三角瓶中，較大的裝液量（低溶氧）有利于菌株F-13對鐵的富集，而較小的裝液量（高溶氧）對菌株F-13生物量的提高比較明顯。綜合考慮細胞生物量和鐵含量，確定培養(yǎng)基裝液量為50 ml/250 ml。

2.2.6 鐵離子濃度對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

為確定不同濃度的Fe2+對酵母生物量及鐵含量的影響，分別配制Fe2+濃度為20、40、60、80、100、120、140、160、180 mg/l的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，然后測定生物量及鐵含量，結(jié)果見圖8。硫酸亞鐵的加入對酵母菌株的生長有抑制作用，但卻促進酵母體內(nèi)鐵富集量的增加。當(dāng)Fe2+的濃度為80～120 mg/l時，酵母生物量及鐵含量達到最大值，當(dāng)Fe2+濃度超過100 mg/l時，菌體總鐵含量降低，分析原因可能是此時培養(yǎng)基中鐵的濃度過高，抑制了酵母的生長和代謝。為確定多因素綜合作用下的最佳條件，試驗選擇Fe2+濃度為80、100、120 mg/l作為正交試驗的3個水平。

圖7 裝液量對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

圖8 鐵離子濃度對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

2.2.7 培養(yǎng)時間對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

在上述培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，為確定最佳菌體培養(yǎng)時間從而使酵母細胞獲得較高的總鐵含量。相同條件下培養(yǎng)菌體不同時間并分別測定其生物量及鐵含量，結(jié)果如圖9所示。在培養(yǎng)時間為12～48 h時，菌體鐵含量剛開始變化不大，之后緩慢增加；菌體生物量，總鐵含量均繼續(xù)緩慢增加；在培養(yǎng)時間為48～60 h時，菌體鐵含量變化不大，而菌體的生物量有所增加，鐵含量仍緩慢上升，總鐵含量達到最大值；當(dāng)培養(yǎng)時間超過60 h后，鐵含量變化不大，生物量及總鐵含量明顯降低。為確定多因素綜合作用下培養(yǎng)溫度的最佳水平，試驗選擇培養(yǎng)時間48、54、60 h作為正交試驗的3個水平。

2.2.8 接種量對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

配制Fe2+添加濃度為100 mg/l的培養(yǎng)基，分別接種不同濃度的液體種子（v/v），使種子濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%，26℃培養(yǎng)48 h，測其生物量及鐵含量，結(jié)果如圖10所示。隨著接種量的增加，鐵含量有下降趨勢但變化不大，而酵母的生物量隨接種量增加而增加，當(dāng)接種量達到10%以后，生物量隨接種量的增加變化不明顯。在接種量為8%～10%范圍內(nèi)，細胞總鐵含量達到最大，隨著接種量的進一步增加，細胞總鐵含量不再變化。

圖9 培養(yǎng)時間對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

2.2.9 溫度對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

微生物的生命活動由一系列的生物化學(xué)反應(yīng)所組成，而這些化學(xué)反應(yīng)受溫度的影響又極其明顯，因此微生物的生長均有其特定的最佳溫度范圍，在最佳溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)微生物能夠促進其生長和代謝活動[19]。結(jié)果如圖11所示，在培養(yǎng)溫度為28℃時，菌體的總鐵含量最高，故選擇培養(yǎng)溫度為28℃。

圖11 培養(yǎng)溫度對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

2.2.10 搖床轉(zhuǎn)速對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

在不同搖瓶轉(zhuǎn)速0、100、150、200、300 r/min條件下觀察菌體生長及發(fā)酵情況，結(jié)果如圖12所示。富鐵酵母在提高轉(zhuǎn)速時菌體生長良好，且隨著轉(zhuǎn)速的提高，菌體生物量有所增加，靜置時菌體生物量明顯低于高轉(zhuǎn)速時的生物量。綜合考慮，雖然提高轉(zhuǎn)速可以增加氧溶解速度，提高酵母菌的產(chǎn)量，但是菌體的含鐵量變化并不明顯，因此試驗中選用的轉(zhuǎn)速為200 r/min。

圖12 搖床轉(zhuǎn)速對菌株F-13細胞生物量及鐵含量的影響

2.3 富集條件的正交優(yōu)化

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，為進一步確定多因素綜合作用下酵母培養(yǎng)的最佳條件，采用正交試驗L9（34），對細胞生物量和鐵含量影響較大的葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、鐵鹽濃度及培養(yǎng)時間4個因子的水平進行了優(yōu)化，每個因子取三種水平進行，正交試驗設(shè)計見表2，結(jié)果表3。當(dāng)僅考慮細胞生物量時，葡萄糖濃度是影響菌株F-13細胞生物量最重要的因子，其次為蛋白胨濃度，再次為培養(yǎng)時間及鐵鹽濃度；當(dāng)僅考慮細胞鐵含量時，鐵鹽濃度是影響菌株F-13細胞鐵含量的最重要因子，其次為培養(yǎng)時間和蛋白胨濃度，再次為葡萄糖濃度；而綜合考慮發(fā)酵液中的細胞總鐵含量時，鐵鹽濃度是影響菌株F-13細胞總鐵含量的最重要因子，其次為葡萄糖濃度，再次為蛋白胨濃度和培養(yǎng)時間。

表2 正交試驗L9（34）因素水平設(shè)計

綜合各因素對總鐵含量的影響，確定菌株最佳培養(yǎng)條件為A2B2C3D1，即葡萄糖濃度40 g/l，蛋白胨濃度10 g/l，鐵離子添加濃度120 mg/l，培養(yǎng)時間48 h。在該條件下進行驗證試驗，所得生物量為3.92 g/l，鐵含量為7.04 mg/g。

表3 正交試驗L9（34）結(jié)果

3 結(jié)論

通過對7株發(fā)酵性接合酵母菌株進行初篩及復(fù)篩，得到1株富鐵能力強的菌株F-13作為出發(fā)菌株，確定其最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度28℃，pH值為6.0，培養(yǎng)基Fe2+添加濃度為120 mg/l，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量10%，裝液量50 ml/250 ml三角瓶，培養(yǎng)時間48 h。在此優(yōu)化條件下獲得的富鐵酵母生物量可達到3.92 g/l，鐵含量可達7.04 mg/g。經(jīng)過篩選及優(yōu)化后，菌株F-13的生物量及富鐵量均有所提高，本試驗所篩選出的菌種以及最佳培養(yǎng)條件為規(guī)?；a(chǎn)鐵酵母提供了參考，但酵母的富鐵能力還不夠理想，單位體積發(fā)酵液中菌體富集的總鐵含量依然較低，為了培育出可用于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌種，有必要對其進行連續(xù)的改良，以便提高菌株的指標性能。