劉 穎，張彬彬，孫冰玉，劉琳琳，鄒麗宏，石彥國*

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

枯草芽孢桿菌高產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉 穎，張彬彬，孫冰玉，劉琳琳，鄒麗宏，石彥國*

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌10075菌株發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到提高菌株中性蛋白酶產(chǎn)量的目的。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分：添加麥芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO40.08%；最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37 ℃、初始pH 7.0、發(fā)酵時(shí)間42 h，酶活力由最初的98.36 U/mL 提高到353.45 U/mL。

枯草芽孢桿菌；中性蛋白酶活力；發(fā)酵；優(yōu)化

中性蛋白酶是最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于生產(chǎn)的工業(yè)酶制劑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面[1-9]，在醫(yī)藥和食品工業(yè)中尤為突出。但中性蛋白酶的產(chǎn)量低、成本高等因素限制其大規(guī)模生產(chǎn)[10-11]。因此，對該酶類生產(chǎn)技術(shù)的研究受到廣泛關(guān)注。微生物蛋白酶，主要由霉菌[12-14]、細(xì)菌，其次由酵母、放線菌生產(chǎn)?？莶菅挎邨U菌是美國食品藥物管理局公布的安全菌種[15]，是當(dāng)今工業(yè)酶的主要生產(chǎn)菌種之一，是工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的菌種之一。目前，由枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的酶制劑占整個(gè)酶制劑市場的50%，主要用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶[16-17]?？莶菅挎邨U菌酶主要應(yīng)用領(lǐng)域是食品工業(yè)，全世界的食品工業(yè)用酶量約占生產(chǎn)總量的60%，在我國則高達(dá)85%以上[18]。

本實(shí)驗(yàn)以中性蛋白酶活力為主要的考察指標(biāo)，對枯草芽孢桿菌 10075的產(chǎn)蛋白酶情況進(jìn)行研究，以碳源、氮源和無機(jī)鹽種類，碳、氮源添加量、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為考察條件，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定菌株產(chǎn)中性蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

枯草芽孢桿菌10075 工業(yè)菌種保藏中心。

種子培養(yǎng)基：氯化鈉5.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L，pH 7.2，121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g/100 mL、牛肉粉2.0 g/100 mL，pH 7.2，121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

干酪素、營養(yǎng)瓊脂、蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；氯化鈉、氯化鈣（分析純） 西隴化工股份有限公司；福林酚試劑 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

單人潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；722型分光光度計(jì) 上海儀分科學(xué)儀器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計(jì) 南京互川電子有限公司；XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；DKZ電熱恒溫振蕩水槽、電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；80-2離心機(jī) 上海浦東光學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌初始發(fā)酵條件

將活化好的斜面菌株接種在種子培養(yǎng)基中（100 mL/25 0 mL），30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，使孢子濃度達(dá)到108個(gè)/mL，菌懸液以2.0%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL/250 mL），30 ℃、pH 7.0、150 r/min培養(yǎng)48 h，以中性蛋白酶酶活力作為評價(jià)指標(biāo)。

1.3.2 中性蛋白酶酶活力測定

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》，采用Folin-酚法測定中性蛋白酶活力[19]。

1.3.3 中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)，分別考察碳源種類及其添加量、氮源種類及其添加量和無機(jī)鹽對產(chǎn)中性蛋白酶的影響。

以2.0%的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉為碳源，2.0%牛肉粉為氮源進(jìn)行發(fā)酵，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源。

1.3.3.2 氮源種類的影響

以2.0%麥芽糖為碳源，以2.0%的牛肉粉、蛋白胨、酵母浸粉、大豆粉、NH4Cl為氮源進(jìn)行發(fā)酵，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳氮源。

1.3.3.3 碳源添加量對菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

以2.0%蛋白胨為氮源，以不同麥芽糖添加量2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%進(jìn)行發(fā)酵，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)碳源添加量。

1.3.3.4 氮源添加量對菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

以8.0%麥芽糖為碳源，以不同蛋白胨添加量2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%進(jìn)行發(fā)酵，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)氮源添加量。

1.3.3.5 無機(jī)鹽對菌種產(chǎn)中性蛋白酶的影響

以8.0%麥芽糖和8.0%蛋白胨為碳氮源，并添加0.04%的KH2PO4、CaCl2、MgSO4、NaCl、FeSO4進(jìn)行發(fā)酵，確定培養(yǎng)基最優(yōu)無機(jī)鹽。

水利現(xiàn)代化規(guī)劃是水利現(xiàn)代化建設(shè)綱領(lǐng)性文件和頂層設(shè)計(jì)，內(nèi)容既包括防洪減災(zāi)、水資源供給、水生態(tài)保護(hù)、城市水利、農(nóng)村水利等功能體系建設(shè)安排，也包括水利社會管理與公共服務(wù)能力、水利發(fā)展保障能力等保障體系建設(shè)安排，是水利全面發(fā)展的規(guī)劃安排，具有明顯的發(fā)展規(guī)劃特征。同時(shí)水利現(xiàn)代化規(guī)劃要根據(jù)區(qū)域自然條件、水利發(fā)展?fàn)顩r和經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展戰(zhàn)略布局，研究本區(qū)水利發(fā)展戰(zhàn)略和發(fā)展模式，提出具有地區(qū)特點(diǎn)和階段特征的水利現(xiàn)代化建設(shè)總體目標(biāo)與布局，對較長時(shí)期的水利建設(shè)和管理具有指導(dǎo)作用，具有一定的戰(zhàn)略性。因此，水利現(xiàn)代化規(guī)劃可定位為具有戰(zhàn)略性的水利發(fā)展規(guī)劃。

1.3.4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定碳源、氮源、無機(jī)鹽這3 個(gè)因素對菌株10075產(chǎn)蛋白酶活力具有顯著性影響（P＜0.05），選取L9（34）正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以中性蛋白酶酶活力為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化。

1.3.5 菌株10075產(chǎn)中性蛋白酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分別考察時(shí)間、溫度、初始pH值對產(chǎn)中性蛋白酶的影響。

2 結(jié)果與分析

圖1 碳源種類對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.1 碳源種類對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響由圖1可知，菌株10075在麥芽糖（P＜0.05）作為碳源時(shí)酶活力最高，為155.05 U/mL，乳糖次之，菌株10075對這兩種碳源的利用效果較好，這可能與菌體蛋白酶系的合成有關(guān)。而葡萄糖作為碳源時(shí)，菌株酶活力最低為98.36 U/mL，可能是葡萄糖對產(chǎn)酶有阻遏或誘導(dǎo)作用。結(jié)果說明二糖比單糖更能促進(jìn)菌體產(chǎn)酶，因而選擇麥芽糖作為碳源。

2.2 氮源種類對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖2 氮源種類對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

在微生物的代謝過程中，氮源主要被轉(zhuǎn)化為核酸、氨基酸以及構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，并且是微生物生長的主要營養(yǎng)。由圖2可知，蛋白胨（P＜0.05）作為氮源時(shí)菌株10075的酶活力最高，為165.05 U/mL。當(dāng)選用NH4Cl作為無機(jī)氮源時(shí)，菌株不產(chǎn)酶，說明NH4Cl不利于產(chǎn)生中性蛋白酶。

2.3 麥芽糖添加量對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響碳源是細(xì)菌發(fā)酵中所需最多的營養(yǎng)物質(zhì)，麥芽糖添加量直接影響菌種的產(chǎn)酶情況。由圖3可知，當(dāng)麥芽糖添加量為培養(yǎng)基總質(zhì)量的2.0%～8.0%時(shí)，菌株10075的蛋白酶活力顯著上升（P＜0.05），達(dá)到8.0%時(shí)對麥芽糖的利用效果最好，產(chǎn)生的酶活力最高，達(dá)到195.06 U/mL，隨著麥芽糖添加量的降低，酶活力有較顯著下降。

圖3 麥芽糖添加量對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.3 Effect of maltose concentration on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.4 蛋白胨添加量對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖4 蛋白胨添加量對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.4 Effect of peptone concentration on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

酶本身是蛋白質(zhì)，而氮元素是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要元素，因此氮源添加量對于產(chǎn)酶有重要作用。實(shí)驗(yàn)測定了不同添加量的蛋白胨對菌株產(chǎn)酶的影響，由圖4可知，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛榕囵B(yǎng)基總質(zhì)量的2.0%～8.0%時(shí)，菌株10075的蛋白酶活力顯著上升（P＜0.05），當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.0 %時(shí)，菌株對氮源的利用效果達(dá)到最好，達(dá)到243.41 U/mL。而當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿扛哂?.0%時(shí)，由于添加量過高，會導(dǎo)致溶液變得黏稠，使底物流動(dòng)性下降，不利于菌株生長及產(chǎn)酶。當(dāng)?shù)鞍纂说奶砑恿坑?.0%增大到8.0%時(shí)，會導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅度提高，而蛋白酶活力由218.40 U/mL提到到243.41 U/mL，僅提高了1.1%，綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)成本問題，最終選定蛋白胨添加量為4.0%。

2.5 無機(jī)鹽對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶活力的影響

由圖5可知，NaCl對菌株10075產(chǎn)酶略有促進(jìn)作用（P＜0.05），Na+能使細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓改變，膜通透能力增加，而微生物原蛋白水解酶均為胞外酶，膜內(nèi)外滲透壓的改變有利于酶向膜外運(yùn)輸，并且NaCl可能對目的菌株具有一定的激活作用，因而產(chǎn)酶效果較好；Mg2+是許多酶的輔助因子，并且參與微生物細(xì)胞壁的形成，產(chǎn)酶效果最好，對產(chǎn)酶具有重要作用[20]。二者均對菌株10075產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用，但MgSO4的效果更好（P＜0.05），這時(shí)酶活力達(dá)到231.74 U/mL，而CaCl2、FeSO4、KH2PO4對產(chǎn)酶有不同程度的抑制作用。

圖5 無機(jī)鹽對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.5 Effect of inorganic salts on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.6 正交試驗(yàn)確定對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶最佳發(fā)酵培養(yǎng)基

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，菌株10075選取對中性蛋白酶活力影響顯著（P＜0.05）的麥芽糖、蛋白胨、MgSO4為考察對象，選用L9（34）分別進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用SPSS17.0進(jìn)行分析，結(jié)果見表1、2。

表1 菌株10075培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of medium components for Bacillus subtilis 10075

表2 枯草芽孢桿菌10075培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Analysis of variance for the optimization of medium components for Bacillus subtilis 10075

菌株10075正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果由表1可知，對蛋白酶活力影響大小為：麥芽糖＞蛋白胨＞MgSO4，優(yōu)化的最優(yōu)產(chǎn)酶條件為A2B2C3，即麥芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO40.08%，在此條件下測得蛋白酶活力為238.40 U/mL，正交表中方案6的條件產(chǎn)酶最高，為231.74 U/mL，因此選取A2B2C3為最優(yōu)結(jié)果，既節(jié)省成本又能達(dá)到理想的效果。由表2方差分析可知，對蛋白酶活力影響大小為：麥芽糖＞蛋白胨＞MgSO4，麥芽糖和蛋白胨均對中性蛋白酶活力有顯著影響，而MgSO4沒有顯著影響。

圖6 發(fā)酵溫度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.6 Effect of temperature on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

2.7 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)中性蛋白酶的影響由圖6可知，發(fā)酵溫度在26～37 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)酶活力呈逐步升高的趨勢（P＜0.05），而當(dāng)培養(yǎng)溫度在37～40 ℃范圍產(chǎn)酶活力下降，由于溫度過高會導(dǎo)致部分酶蛋白變性失活，化學(xué)反應(yīng)速率和代謝減弱，代謝產(chǎn)物減少，最初大量繁殖的細(xì)菌會分解代謝產(chǎn)生熱量，使底物濃度更高，促進(jìn)細(xì)菌衰老[21]。菌株10075在37 ℃時(shí)達(dá)到最適溫度，此時(shí)酶活力達(dá)到238.40 U/mL。溫度不僅影響各種酶的反應(yīng)速率和蛋白質(zhì)性質(zhì)，還會影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。溫度升高使反應(yīng)速率和生長代謝加快，提高微生物代謝物產(chǎn)量，但會導(dǎo)致菌體衰老，并縮短了發(fā)酵周期，使產(chǎn)酶量減少。

2.8 發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖7 發(fā)酵時(shí)間對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.7 Effect of fermentation time on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

發(fā)酵時(shí)間影響影響菌體的生長情況和蛋白酶產(chǎn)量。由圖7可知，在發(fā)酵24 h內(nèi)，發(fā)酵液中產(chǎn)酶量很低，培養(yǎng)時(shí)間在24～42 h時(shí)，菌株蛋白酶的活力在逐漸的上升（P＜0.05），而當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在42 h時(shí)，蛋白酶的活力達(dá)到最大值。在之后的延長培養(yǎng)時(shí)間，蛋白酶的活力有明顯的（P＜0.05）下降趨勢，因?yàn)樵诎l(fā)酵后階段，底物不斷消耗的同時(shí)，微生物也在逐漸衰亡，導(dǎo)致產(chǎn)酶下降。最佳培養(yǎng)時(shí)間確定為42 h，此時(shí)菌株10075酶活力達(dá)到353.45 U/mL。

2.9 初始pH值對菌株產(chǎn)中性蛋白酶的影響

圖8 初始pH值對枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的影響Fig.8 Effect of initial medium pH on neutral protease activity produced by Bacillus subtilis

由于發(fā)酵過程中的pH值很難準(zhǔn)確控制，所以選擇控制發(fā)酵液的初始pH值。由圖8可知，菌株的初始pH值在7.0～8.0范圍內(nèi)產(chǎn)酶效果較好（P＜0.05），pH 7.0時(shí)，菌種10075酶活力最高，為353.45 U/mL。說明中性培養(yǎng)基有利于菌株產(chǎn)酶；酸性培養(yǎng)基不利于菌株產(chǎn)酶。pH值通過影響菌體營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度、細(xì)胞膜電荷及膜滲透性，影響菌體對養(yǎng)分的吸收。對于大多數(shù)菌種來說，一般具保持其體內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)酸度在近中性條件下的能力，利于新陳代謝和各種酶反應(yīng)，底物的pH值對細(xì)胞的新陳代謝和產(chǎn)酶有間接的影響，在不同的初始pH值條件下菌株的生長繁殖能力和產(chǎn)中性蛋白酶的能力存在著一定的差異。

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化培養(yǎng)基條件：碳源種類及添加量、氮源種類及添加量和無機(jī)鹽種類的單因素試驗(yàn)，進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定菌株10075最優(yōu)培養(yǎng)基為麥芽糖8.0%、蛋白胨4.0%、MgSO40.08%，培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果為pH7.0、發(fā)酵時(shí)間42 h、發(fā)酵溫度37 ℃，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，酶活力由98.36 U/mL 提高到353.45 U/mL。

本實(shí)驗(yàn)確定了產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳無機(jī)鹽種類，但是對無機(jī)鹽添加量的多少并沒有進(jìn)行單因素試驗(yàn)，會對結(jié)果產(chǎn)生一定影響。并且一些表面活性劑也可能會促進(jìn)產(chǎn)酶，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。芽孢桿菌能夠分泌多種酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等[22]，產(chǎn)生酶系的種類與產(chǎn)酶量密切相關(guān)，因此實(shí)驗(yàn)菌株要應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，應(yīng)對其產(chǎn)生的多種酶進(jìn)行系統(tǒng)的檢測，明確相互之間的影響，并對生產(chǎn)成本與產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行辨證考慮，才能最終確定最佳的工業(yè)發(fā)酵條件。利用枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶，具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)酶量高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，枯草芽孢桿菌菌株對紫外線敏感，可利用紫外誘變進(jìn)行菌種選育，能夠進(jìn)一步提高其酶的產(chǎn)量[23-24]。

[1] SCHALLMEY M, SINGH A, WARD O P. Developments in the use of Bacillus species for industrial production[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2004, 50: 1-17.

[2] DEMAIN A L, ADRIO J L. Contributions of microorganisms to industrial biology[J]. Molecular Bioteehnology, 2008, 38(1): 41-55.

[3] 牛春華, 高巖, 李玉秋, 等. 紫外誘變選育高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌[J].中國釀造, 2011, 30(12): 67-69.

[4] 王和玉, 楊帆, 林琳, 等. 地衣芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析[J].釀酒科技, 2011(9): 32-34.

[5] 楊帆, 林琳, 王和玉, 等. 茅臺大曲中3株芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的比對分析[J]. 釀酒科技, 2011(8): 42-43.

[6] 豆康寧, 董彬, 王銀滿. 大豆蛋白活性肽的生物功能與應(yīng)用前景[J].糧食加工, 2007, 32(2): 52-54.

[7] 武波波, 李文獻(xiàn), 王少武, 等. 微膠囊化中性蛋白酶的技術(shù)研究[J].中國乳品工業(yè), 2009, 37(8): 27-30.

[8] 肖懷秋, 林親錄, 李玉珍, 等. 中性蛋白酶芽孢桿菌BX-4產(chǎn)酶條件及部分酶學(xué)性質(zhì)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2005, 24(4): 42-46; 56.

[9] 李明陽. 復(fù)合菌種發(fā)酵海鮮魚露工藝條件探討究[D]. 西安: 西北大學(xué), 2012.

[10] 孫曉鳴, 王萍, 鄔向東. 產(chǎn)中性蛋白酶芽孢桿菌配伍發(fā)酵響應(yīng)面法研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2010, 10(2): 117-124.

[11] 黃璠, 蔡俊. 枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 飼料工業(yè), 2012, 33(2): 49-51.

[12] TREMACOLDI C R, WATANABE N K, CARMONA E C. Production of extracellular acid proteases by Aspergillus clavatus[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2004, 20(6): 639-642.

[13] KUMAR S, SHARMA N S, SAHARAN M R, et al. Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae: purification and characterization[J]. Process Biochemistry, 2005, 40(5): 1701-1705.

[14] FERNANDEZ-LAHORE H M, AUDAY R M, FRAILE E R, et al. Purification and characterization of an acid proteinase from mesophilic Mucor sp. solid-state cultures[J]. The Journal of Peptide Research, 1999, 53(6): 599-605.

[15] 閆亞婷. 固態(tài)發(fā)酵玉米條件的優(yōu)化及營養(yǎng)物質(zhì)變化的比較研究[D].雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[16] 陳曉明, 張良, 張建國, 等. 枯草芽孢桿菌淀粉酶高產(chǎn)菌株的輻射誘變研究[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào), 2008, 26(3): 177-182.

[17] 馬明, 杜金華. 枯草芽孢桿菌酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 山東科學(xué), 2006, 19(3): 35-38.

[18] 何國慶. 食品發(fā)酵與釀造工藝學(xué)[M]. 2版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 51-59.

[19] 中華人民共和國國家技術(shù)監(jiān)管局. GB/T23527—2009蛋白酶制劑[S].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

[20] PRESCOT M L, HARLEY P J, KLEIN A D. Microbiology[M]. New York: McGraw-Hill Companies Inc., 2002: 96-121.

[21] 張慧濤, 侯新強(qiáng). 高溫中性蛋白酶發(fā)酵過程中溫度控制的改進(jìn)[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2002, 28(6): 80-82.

[22] 袁小平, 王靜, 姚惠源. 枯草芽孢桿菌內(nèi)切木聚糖酶的純化與性質(zhì)研究[J] . 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(8): 55-59.

[23] 施巧琴, 吳松剛. 工業(yè)微生物育種學(xué)[M]. 3版. 北京: 科學(xué)出版社, 2009.

[24] 張敏, 趙叢, 路福平, 等. 產(chǎn)中性蛋白酶菌株發(fā)酵條件的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2007, 28(12): 44-48.

Optimization of Fermentation Conditions for Production of Neutral Protease by Bacillus subtilis 10075

LIU Ying, ZHANG Bin-bin, SUN Bing-yu, LIU Lin-lin, ZOU Li-hong, SHI Yan-guo*
(Key Laboratory for Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The medium components and culture conditions for Bacillus subtilis 10075 were optimized by single-factor and orthogonal array design methods to increase the production of neutral protease. The results showed that the optimized medium consisted of 8.0% maltose, 4.0% peptone and 0.08% MgSO4, and the optimized culture conditions were 37 ℃, 7.0 and 42 h for temperature, initial pH and time, respectively. The activity of neutral protease after optimization was increased from 98.36 to 353.45 U/mL.

Bacillus subtilis; neutral protease activity; fermentation; optimization

Q939.97；TS201.3

A

1002-6630（2014）13-0166-05

10.7506/spkx1002-6630-201413032

2013-08-05

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B03）

劉穎（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：154057693@qq.com

*通信作者：石彥國（1960—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)榇蠖?、谷物化學(xué)及加工。E-mail：yanguosh@163.com