鄭茜茜，夏博能，沈 駿，吳曉琴，沈建福

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

5α-還原酶（5 alpha-reductase，EC1.3.99.5）是定位于靶細(xì)胞微粒體上的膜蛋白，依賴還原型輔酶ⅡNADPH作為供氫體，催化還原雄激素睪酮（T）轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿鼜?qiáng)的雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）[1]。5α-還原酶異常表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致組織中DHT積聚，DHT含量過高會(huì)引起某些疾病如良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）、多毛癥、男性脫發(fā)等，其中BPH 的發(fā)病率在60歲男性中為50%，80歲以上男性中高達(dá)90%[2]。目前國內(nèi)外臨床上廣泛使用非那雄胺（finasteride）、度他雄胺（dutasteride）[3]等作為治療藥物。該類藥物的作用機(jī)制是通過抑制5α-還原酶活性，阻斷DHT合成來治療BPH，作為合成藥物不僅價(jià)格較昂貴而且會(huì)產(chǎn)生一定副作用。近些年研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物性多酚類、三萜類、甾體類等化合物對(duì)5α-還原酶有較強(qiáng)抑制活 性，目前臨床已應(yīng)用的天然5α-還原酶抑制劑有鋸葉提取物棕（伯泌松）、非洲臀果木提取物（通尿靈）、油菜花粉提取物（前列康）、黑麥提取物（舍尼通）[4-6]等，從天然植物中篩選高效低毒的5α-還原酶抑制劑逐漸成為研究開發(fā)的熱點(diǎn)。

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）木本植物，為我國重要的木本油料作物，油茶蒲為油茶果的外殼，約占油茶果總質(zhì)量的2/3，為油茶加工廢棄物[7]，在振興油茶產(chǎn)業(yè)的同時(shí)有效地開發(fā)利用油茶蒲等副產(chǎn)物具有積極的意義。本實(shí)驗(yàn)前期研究證實(shí)油茶蒲提取物（oiltea camellia extracts，OCE）對(duì)5α-還原酶具有很強(qiáng)的抑制活性[8]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)OCE能有效改善大鼠前列腺增生癥狀[9]，是5α-還原酶的高效抑制劑。

目前從天然植物中分離提取5α-還原酶抑制活性部位的研究大多數(shù)采用硅膠色譜法[10-14]，采用聚酰胺色譜法進(jìn)行活性部位篩選的研究國內(nèi)外還未見相關(guān)報(bào)道。聚酰胺色譜法[15]是指以聚酰胺為吸附劑的吸附色譜法，包括薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）和柱色譜（column chromatography，CC）兩大類。聚酰胺（polyamide）是通過聚酰胺基聚合而成的一類高分子化合物，分子中含有豐富的酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵結(jié)合而被吸附，與不能形成氫鍵的化合物分離[16]。聚酰胺具有“雙重色譜”的性能，特別適合用于分離黃酮、酚類和醌類等化合物，對(duì)鞣質(zhì)具有極強(qiáng)的幾乎不可逆的吸附作用，故可作為脫鞣方法[17]。本實(shí)驗(yàn)以5α-還原酶的抑制率為指針，采用TLC和CC分離，通過HPLC檢測(cè)，篩選抑制5α-還原酶的活性部位，旨在為OCE中抑制5α-還原酶的關(guān)鍵化合物制備，及天然植物類5α-還原酶抑制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通白花油茶蒲 浙江省常山縣芳村鎮(zhèn)；AB-8型大孔樹脂 滄州寶恩樹脂有限公司；聚酰胺（100～200 目） 上海源葉生物科技有限公司；聚酰胺薄層板（10 cm×20 cm，10 cm×10 cm） 北京京京未來科技發(fā)展有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%） 比利時(shí)Acros公司；3-O-甲基鞣花酸-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖（3-O-methyl-D-glucopyranose，MEAG，純度＞95%） 實(shí)驗(yàn)室自制；乙腈、甲醇（色譜純）美國Merk公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

雌性SD大鼠3 只，體質(zhì)量250～300 g 浙江大學(xué)紫金港動(dòng)物中心。

睪酮（T）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）美國Sigma公司；1,4-二硫代蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS124S萬分之一電子分析天平 德國Sartorius公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；玻璃層析柱（Φ3.6 cm×40 cm）、BSZ-100自動(dòng)部分收集器上海滬西分析儀器廠；XY層析缸（10 cm×20 cm）上海暢輝化工儀器有限公司；玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管（內(nèi)徑0.3 mm） 華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；Waters 2695高效液相色譜儀（配有2996 PDA檢測(cè)器） 美國沃特世公司；Unitary Luna C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）北京華譜新創(chuàng)科技有限公司；Centrifuge 5810R高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Himac CP-80β超高速離心機(jī)日本日立公司；T10BS25勻漿機(jī) 德國IKA公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶蒲提取物的分離純化

1.3.1.1 油茶蒲提取物的制備

將油茶蒲干燥，粉碎至60 目，用50%（V/V）乙醇溶液85 ℃（料液比1∶10）熱回流提取2 h，過濾，濾液減壓濃縮去除乙醇后上AB-8大孔樹脂柱，以40%（V/V）乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，即可制得油茶蒲提取物（oiltea camellia extracts，OCE），總酚含量為（37.58±1.68）%。

1.3.1.2 聚酰胺薄層層析

聚酰胺薄層層析采用的展開劑為正丁醇-甲醇-水-冰醋酸（體積比為3∶2∶2∶1）；顯色劑為0.5 g/100 mL FeCl3-乙醇溶液。

將新鮮配制的展開劑加入到層析缸中，密閉放置15 min。用毛細(xì)管分別吸取適量供試液，以垂直方向小心接觸薄層板面，做條帶狀點(diǎn)樣，點(diǎn)樣基線距底邊1 cm，樣品原點(diǎn)之間距離1.5 cm。將點(diǎn)樣后的薄層板放入已達(dá)預(yù)平衡的層析缸中，密閉，上行展開，薄層板浸入展開劑中的深度要求溶劑的液面距原點(diǎn)約5 mm，展開至8 cm展距后，立即取出薄層板，晾干，以備檢測(cè)。將已晾干的薄層板放入裝有顯色劑的容器中，待充分顯色后取出晾干[18]。根據(jù)比移值Rf合并相近組分，分離部位分別減壓濃縮干燥，稱量Fr干基質(zhì)量，進(jìn)而計(jì)算各Rf值相近組分的得率。

式中：L為原點(diǎn)中心到譜帶中心的距離/cm；L0為原點(diǎn)中心到溶劑前沿的距離/cm。

1.3.1.3 聚酰胺柱層析

聚酰胺預(yù)處理：用95%（V/V）乙醇溶液浸泡聚酰胺粉24 h，溶脹后濕法上柱。用3～4 倍柱體積的95%乙醇溶液洗至流出液透明為止，再依次用2.5 倍柱體積的5 g/100 mL NaOH水溶液、1 倍柱體積的蒸餾水、2.5 倍柱體積的10%（V/V）醋酸水溶液洗脫，最后用蒸餾水洗至流出液pH值呈中性，備用。

裝柱：將顆粒狀聚酰胺混懸于水中，使其充分膨脹，濕法上柱，裝柱后液面必須高于樹脂20～40 mm，讓聚酰胺自由沉降，待穩(wěn)定后用適量洗脫液沖洗樹脂柱。

上樣：將OCE充分溶解于適量洗脫 劑中，上樣至經(jīng)過預(yù)處理的聚酰胺樹脂柱。

洗脫：用正丁醇-甲醇-水-冰醋酸（3∶2∶2∶1）混合液洗脫，流速1 mL/min，流出液每5 min分管自動(dòng)收集。

1.3.2 高效液相色譜法（high performance liq uid chromatography，HPLC）檢測(cè)

1.3.2.1 進(jìn)樣液制備

OCE及Fr1～Fr7用蒸餾水配成1 mg/mL溶液，用甲醇配制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.216 mg/mL），用二甲基亞砜配制鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.223 mg/mL），用甲醇配制MEAG標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.226 mg/mL），過0.45 μm濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)。

1.3.2.2 檢測(cè)色譜條件

色譜柱：Luna C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長254 nm；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：1%乙酸水溶液；梯度洗脫：0～8 min，5%～10% A；8～16 min，10% A；16～25 min，10%～15% A；25～30 min，15% A；30～35 min，15%～20% A；35～40 min，20% A；40～45 min，20%～5% A；45～50 min，5% A。

1.3.3 5α-還原酶的抑制活性檢測(cè)

1.3.3.1 試劑的配制

睪酮溶液：精密稱取36 mg睪酮，無水乙醇定容至25 mL，濃度為5 mmol/L。

NADPH四鈉鹽溶液：精密稱取NADPH四鈉鹽42.5 mg，用蒸餾水溶解并定容至25 mL，濃度2 mmol/L。

提酶緩沖液：0.32 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L磷酸鈉，pH 6.5。

反應(yīng)液：1 mmol/L DTT，40 mmol/L磷酸鈉，pH 6.5。

1.3.3.2 大鼠5α-還原酶的制備方法

取清潔級(jí)雌性SD大鼠3 只，禁食不禁水過夜后脫頸椎處死，取出肝臟冰臺(tái)上剪碎。用預(yù)冷的緩沖液和玻璃勻漿器制成1∶5勻漿，4℃、10 000×g條件下離心15 min，取胞漿部分100 000×g條件下離心1 h，倒掉上清，沉淀即為粗微粒提取物。加入一定體積緩沖液，并用勻漿器進(jìn)行勻漿懸浮。分裝，-80 ℃冰箱保存。

1.3.3.3 5α-還原酶蛋白質(zhì)含量測(cè)定

利用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定5α-還原酶懸濁液蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（g/L）。

1.3.3.4 5α-還原酶抑制活性測(cè)定

2 mL反應(yīng)體系中，睪酮20 μmol/mL，NADPH 40 μmol/mL，酶260 μg，在37 ℃反應(yīng)液中反應(yīng)4 min，248 nm波長處檢測(cè)（睪酮溶液最大吸收波長，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.009 9x+0.003 5，R2=0.999 6），抑制率的計(jì)算見下式。

式中：A0為空白斜率（乙醇+NADPH+酶）；A1為反應(yīng)斜率（T+NADPH+酶）；A2為樣品斜率（T+NADPH+樣品+酶）。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚酰胺薄層層析結(jié)果

在薄層層析條件的摸索過程中，由于硅膠比聚酰胺對(duì)極性大的化合物吸附作用更強(qiáng)，樣品TLC檢測(cè)容易出現(xiàn)分離度不夠（Rf≤0.48）、拖尾嚴(yán)重、譜帶黏連等情況，故選擇聚酰胺色譜法。當(dāng)向展開劑體系中添加一定比例的冰醋酸后，可明顯減少拖尾并改善譜帶形狀。原因在于冰醋酸的添加增加了展開劑的極性，抑制了化合物中羧基解離，從而有利于羧酸類化合物的展開[15]，考慮到OCE總酚含量較高（37.58±1.68）%，所以推測(cè)OCE中含有一定量的酚酸類化合物。

圖1 油茶蒲提取物柱層析分離產(chǎn)物Fr1～Fr7的TLC圖Fig.1 TLC pro file of Fr1 through FFrr7

參照1.3.1.3節(jié)柱層析方法，OCE上樣8.00 g，柱層析洗脫后共收集410 管，總體積3 026 mL，回收率36.62%，經(jīng)聚酰胺柱層析后得到7 個(gè)分離部位Fr1～Fr7。由薄層層析結(jié)果（圖1）可知，OCE分離度顯著，譜帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象；Fr3、Fr5、Fr6只含單一譜帶，F(xiàn)r2含3 條譜帶，F(xiàn)r1、Fr4、Fr7所含化合物未得到有效分離。此外由表1可知，F(xiàn)r1得率（20.02%）顯著高于其他分離部位，F(xiàn)r2得率（6.11%）次之，F(xiàn)r4得率最低（僅為0.62%）。樣品回收率較低是因?yàn)榫埘０穼?duì)鞣質(zhì)具有極強(qiáng)的吸附作用，所以O(shè)CE中含有的大量鞣質(zhì)被吸附在聚酰胺柱上未被洗脫，由5α-還原酶抑制率檢測(cè)結(jié)果可知鞣質(zhì)類化合物對(duì)5α-還原酶無顯著抑制作用，因此用聚酰胺進(jìn)行脫鞣處理，以利于OCE中活性成分的有效富集。

表1 油茶蒲提取物柱層析分離產(chǎn)物Fr1～Fr7Table 1 Column chromatographic separation of fractions Fr1 through Fr7 of OOCCEE

2.2 HPLC檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.2 HPLC pro file of standard substances

由圖2所知，沒食子酸（gallic acid，GA）、鞣花酸（ellagic acid，EA）、MEAG為OCE中主要特征酚類化合物，出峰時(shí)間分別為6.783、39.559、38.541 min。

2.2.2 Fr1～Fr7的HPLC圖譜

圖3 Fr1～Fr7的HPLC圖Fig.3 HPLC pro files of Fr1 through FFrr7

由圖3可知，OCE、Fr1、Fr4、Fr7峰型多樣，顯示其組成較為復(fù)雜；Fr2、Fr3、Fr5、Fr6峰型較為單一，顯示其組成較為簡單，主要化合物的純度較高；與標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖對(duì)照，發(fā)現(xiàn)Fr2中含有GA，F(xiàn)r7中含有EA，而Fr2、Fr3及Fr4均含有MEAG。

2.3 Fr1～Fr7的5α-還原酶的抑制活性

通過Fr1～Fr7對(duì)5α-還原酶抑制活性的檢測(cè)，結(jié)果表明7 個(gè)分離部位中Fr4和Fr5的抑制活性最高，抑制率分別為（73.01±2.93）%和（76.28±1.37）%，比純化前OCE的抑制率（57.79±1.67）%顯著增加，其余4 個(gè)分離部位的抑制活性都不及OCE，說明OCE中具有高效抑制活性的關(guān)鍵化合物在Fr4和Fr5中得到了有效富集。由于Fr4得率僅為0.64%，明顯低于Fr5的得率2.10%，且HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示Fr4組成較為復(fù)雜，因此可以選擇Fr5作為活性部位進(jìn)一步制備抑制5α-還原酶的單體化合物。

圖4 Fr1～Fr7的 5α-還原酶抑制率Fig.4 Inhibition rates of Fr1 through FFrr7 on 5α-reductase

液相圖譜顯示Fr2中沒食子酸和MEAG的峰面積所占百分比分別為13.63%和80.18%，但Fr2抑制率（39.43%）低于OCE；Fr7中鞣花酸的峰面積所占百分比為35.12%，但Fr7抑制率（50.72%）也低于OCE。圖4結(jié)果表明沒食子酸、鞣花酸及MEAG的抑制率均在15%以下，顯著低于OCE的抑制率（57.79%）。由上述推測(cè)OCE中抑制5α-還原酶的關(guān)鍵化合物并不是沒食子酸、鞣花酸及MEAG。這與Hirano等[19]從娑羅雙屬樹的心材中分離得到5 種鞣質(zhì)類化合物中沒食子酸和鞣花酸對(duì)5α-還原酶沒有抑制活性（5α-還原酶剩余活性分別為99%和97%）的結(jié)果吻合。

3 結(jié) 論

應(yīng)用聚酰胺色譜法能夠有效分離純化OCE中抑制5α-還原酶的活性部位。分離純化得到的7個(gè)部位中Fr4和Fr5抑制活性最強(qiáng)，抑制率分別為（73.01±2.93）%和（76.28±1.37）%，較OCE純化前的抑制率（57.79±1.67）%顯著增加，其中Fr5得率為2.10%，組成較為單一，這為進(jìn)一步制備OCE中抑制5α-還原酶的關(guān)鍵化合物奠定了基礎(chǔ)。

Hiipakka等[20]通過體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了多酚類物質(zhì)對(duì)5α-還原酶抑制的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)酚類物質(zhì)（尤其異黃酮、黃豆苷、染料木黃酮和山萘酚）對(duì)5α-還原酶具有較強(qiáng)的抑制活性。油菜花粉、仙人掌、何首烏、交趾黃檀、知母、朝鮮當(dāng)歸、高良參、楊梅樹皮等提取物均分離出相應(yīng)的活性化合物[21-23]。課題組前期研究表明，OCE中多酚類物質(zhì)含量較高（37.58±1.68）%，而且多酚類物質(zhì)的含量與其5α-還原酶的抑制率成正相關(guān)[24]，因此OCE中5α-還原酶抑制的關(guān)鍵化合物極有可能是多酚類物質(zhì)。

天然產(chǎn)物活性成分的層析分離技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的是硅膠色譜法。硅膠吸附分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，因此極性小的混合物體系適合用硅膠柱等正相吸附劑來分離[25]。以酚酸類化合物為主的油茶蒲提取物（OCE）極性較強(qiáng)，再加上羧基是極性很大的取代基，易解離成鹽，與硅膠吸附較強(qiáng)，所以O(shè)CE在用硅膠薄層層析（TLC）做成分預(yù)試時(shí)極易被硅膠死吸附，造成樣品損失嚴(yán)重及分離效果不理想（Rf≤0.48，譜帶黏連，嚴(yán)重拖尾）。

適合強(qiáng)極性化合物分離的吸附材料有聚酰胺、反相硅膠、葡聚糖凝膠等，但是反相硅膠、葡聚糖凝膠價(jià)格較為昂貴，對(duì)于上樣量較大的樣品分離最好選用聚酰胺。聚酰胺對(duì)于黃酮、蒽醌等多羥基酚性化合物的吸附分離效果要明顯優(yōu)于硅膠。聚酰胺吸附分離原理是通過分子中酰胺基的羰基與酚類化合物中的羥基形成氫鍵而被吸附，與不能形成氫鍵的化合物分離，特別適合多元酚類化合物的分離[26]。而且聚酰胺對(duì)鞣質(zhì)具有極強(qiáng)的幾乎不可逆的吸附作用，滿足本實(shí)驗(yàn)中除鞣質(zhì)的需求（沒食子酸、鞣花酸、MEAG不具有顯著5α-還原酶抑制活性），從而使活性成分得到有效富集。因此聚酰胺色譜法較硅膠色譜法更適合分離強(qiáng)極性的酚酸類混合物體系。

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