尹金鳳，王志軒，吳欣森，李泓全，徐大剛*，童海寶，董宏偉*

（上海化工研究院，上海 200062）

β-胡蘿卜素是生物體內(nèi)合成VA的前體物質(zhì)，為許多具有鮮亮顏色的動(dòng)、植物組織中的主要色素成分。迄今為止，它是類(lèi)胡蘿卜素家族中研究最為充分的一種四萜化合物。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該化合物有抗氧化、促進(jìn)動(dòng)物組織發(fā)育、提高免疫力以及抗癌等多種生物活性[1]。近年來(lái)，由于β-胡蘿卜素的生物功能日益明晰，有關(guān)β-胡蘿卜素的相關(guān)研究也備受重視。

目前，β-胡蘿卜素的主要生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、植物提取法、鹽藻萃取法和生物合成法。其中化學(xué)合成法生產(chǎn)成本低廉，但由于產(chǎn)品存在有害物質(zhì)殘留問(wèn)題，因此成為限制其應(yīng)用的瓶頸。植物提取法是最早發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素的方法，也是早期獲取天然β-胡蘿卜素的重要手段[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道[3]，目前已研究培育出β-胡蘿卜素含量比較高的胡蘿卜新品系，可以為天然β-胡蘿卜素的生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)原料。但由于胡蘿卜生產(chǎn)容易受到地理、氣候、時(shí)間和空間的限制，因此很難實(shí)現(xiàn)廉價(jià)β-胡蘿卜素的大規(guī)模工業(yè)制備。杜氏鹽藻（Dunaliella salina）培養(yǎng)是獲取天然β-胡蘿卜素的另一重要來(lái)源[2]。但由于鹽藻培養(yǎng)需要強(qiáng)烈的光照和高濃度的鹽分，因此對(duì)生產(chǎn)的氣候條件和地理環(huán)境提出了極高的要求；另外，該生產(chǎn)過(guò)程通常為開(kāi)放式培養(yǎng)，因此生產(chǎn)過(guò)程控制困難，產(chǎn)品品質(zhì)難以保障。微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素由于不受光照、氣候、產(chǎn)地等環(huán)境條件的限制，加之產(chǎn)品具有經(jīng)濟(jì)、安全和著色力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，因此該技術(shù)受到國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的廣泛青睞。

三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）具有生長(zhǎng)迅速、生物量大、單位菌體β-胡蘿卜素產(chǎn)量高等明顯優(yōu)勢(shì)，是生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的理想菌株，在東歐早已應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[4]。該霉菌屬于接合菌綱、毛霉目、笄霉科、布拉氏霉菌屬，有正負(fù)兩種菌株，能產(chǎn)生發(fā)達(dá)的菌絲，為長(zhǎng)管單細(xì)胞低等真菌。正負(fù)菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，表現(xiàn)為菌絲的延長(zhǎng)和分支，細(xì)胞核的裂殖增多，以及細(xì)胞質(zhì)的增加。在此過(guò)程中，兩種菌株只能合成少量的類(lèi)胡蘿卜素，并無(wú)性繁殖生成孢子囊和孢囊孢子[5-6]。除此之外，正負(fù)菌株也可異宗結(jié)合，并通過(guò)有性繁殖形成接合孢子[7-8]。有研究表明，接合孢子的形成與β-胡蘿卜素合成有密切關(guān)系。在正負(fù)菌混合發(fā)酵過(guò)程中，性激素類(lèi)物質(zhì)——三孢酸（也曾命名為β因子）的大量生成，對(duì)三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素起到重要的促進(jìn)作用[9]。

基于三孢布拉氏霉菌的生理、結(jié)構(gòu)和代謝特點(diǎn)，在其誘變選育與β-胡蘿卜素發(fā)酵的研究中逐漸形成了較為獨(dú)特的技術(shù)體系。本文從菌種選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化等角度，對(duì)三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，并對(duì)其研究趨勢(shì)和發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 1 β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育

三孢布拉氏霉菌為典型低等真菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即無(wú)隔膜的絲狀真菌[10]。為了方便誘變及后續(xù)處理操作，通常以三孢布拉氏霉孢子作為處理對(duì)象，并利用各種化學(xué)和物理手段對(duì)正負(fù)菌孢子分別進(jìn)行誘變處理。為實(shí)現(xiàn)菌種選育工作的高效實(shí)施，逐漸根據(jù)三孢布拉氏霉菌的生理和代謝特點(diǎn)，形成了獨(dú)具特色的誘變和篩選技術(shù)體系，也為進(jìn)一步建立三孢布拉氏霉菌高通量育種技術(shù)體系奠定了基礎(chǔ)。

1.1 三孢布拉氏霉菌分離篩選技術(shù)的研究進(jìn)展

三孢布拉氏霉菌孢子涂布于PDA固體培養(yǎng)基表面后，孢子會(huì)萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲體并不斷的延伸以及分枝，無(wú)法形成規(guī)則且界限清晰可辨的圓形菌落。以大小為9 cm的常規(guī)篩選平板為例，當(dāng)平板上的菌落數(shù)量超過(guò)10個(gè)以上時(shí)，三孢布拉氏霉極易因菌絲體的蔓延而導(dǎo)致菌落間的相互交叉，從而無(wú)法保證菌株分離純化的效果。

有關(guān)三孢布拉氏霉菌落分離純化技術(shù)的研究，最早見(jiàn)于1977年。Kharabrova等[11]首次通過(guò)應(yīng)用麥芽汁瓊脂雙層平板，從而使得三孢布拉氏霉菌在固體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)方式，從連續(xù)性菌絲蔓延生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)榫湫途奂L(zhǎng)。在一定程度上，該方法有效地解決了三孢布拉氏霉菌落分離純化的技術(shù)問(wèn)題。在改善工作效果和提高工作效率的同時(shí)，也有效降低了實(shí)驗(yàn)操作人員的工作量。

另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]，脫氧膽酸鈉作為一種離子型表面活性劑，可以通過(guò)改變菌體細(xì)胞膜的通透性而發(fā)揮抑制真菌菌絲體生長(zhǎng)的作用。在三孢布拉氏霉菌落的篩選過(guò)程中，脫氧膽酸鈉可使菌體在固體培養(yǎng)基表面形成較為規(guī)整和界限清晰的圓形菌落。早在1995年的1 項(xiàng)國(guó)際專(zhuān)利中，F(xiàn)inkelstein等[14]就開(kāi)始將該技術(shù)應(yīng)用于三孢布拉氏霉誘變后孢子的篩選操作。在國(guó)內(nèi)，劉海麗等[12]在固體篩選培養(yǎng)基添加聚乙二醇辛基苯基醚（乳化劑OP）或脫氧膽酸鈉，并對(duì)兩種抑制劑的應(yīng)用效果進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳化劑OP對(duì)三孢布拉氏霉菌體生長(zhǎng)的抑制效果較為強(qiáng)烈（最適劑量0.5 g/L），脫氧膽酸鈉對(duì)菌體細(xì)胞的抑制作用相對(duì)較?。ㄗ钸m劑量0.75 g/L）。具體表現(xiàn)為：脫氧膽酸鈉固體培養(yǎng)基表面的氣生菌絲數(shù)量與菌落數(shù)量略高于含有乳化劑OP的篩選平板[12]。

1.2 高產(chǎn)β-胡蘿卜素菌誘變技術(shù)的研究進(jìn)展

誘變技術(shù)，即通過(guò)各類(lèi)物理、化學(xué)和輻照等手段，而引起物種的遺傳變異[15]?；谌卟祭厦棺陨淼纳砗痛x特點(diǎn)，長(zhǎng)期誘變選育工作中積累的研究經(jīng)驗(yàn)又反饋于誘變方案的設(shè)計(jì)，并發(fā)展出具有針對(duì)性的誘變技術(shù)。

1.2.1 化學(xué)誘變技術(shù)及其在三孢布拉氏霉菌組合誘變中的應(yīng)用

化學(xué)誘變技術(shù)是一種簡(jiǎn)便易行廣泛應(yīng)用的生物物種誘變技術(shù)。在1995年的國(guó)際專(zhuān)利中，F(xiàn)inkelstein等[14]就建議可以利用1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG）、甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate，EMS）、亞硝酸，核苷酸類(lèi)似物，吖啶類(lèi)化合物（acridines）等多種化學(xué)誘變劑，并可結(jié)合紫外線（UV）、X射線、γ射線等誘變技術(shù)，對(duì)三孢布拉氏霉菌進(jìn)行遺傳選育。在其具體實(shí)施中，主要采用以EMS、UV，尤其是50～500 μg/mL的NTG對(duì)三孢布拉氏霉菌負(fù)菌株（ATCC 14272）進(jìn)行反復(fù)多輪誘變篩選，并最終使得β-胡蘿卜素的發(fā)酵水平由2.7 g/L最高提至7.0 g/L。

此外，Mehta等[6,16]以NTG對(duì)三孢布拉氏霉正負(fù)菌孢子（正菌F986和負(fù)菌F921）進(jìn)行處理，并獲得高產(chǎn)突變菌株（正菌SB39、負(fù)菌SB32）。通過(guò)采用正負(fù)菌混合培養(yǎng)，突變株菌絲體β-胡蘿卜素含量（（28.2±5.8）mg/g菌體干質(zhì)量）相對(duì)初始正負(fù)菌株（（4.3±1.1）mg/g菌體干質(zhì)量）提高了約6倍。Perez等[17]則采用UV、EMS、亞硝酸和NTG對(duì)三孢布拉氏霉菌孢子（正菌VKPM F-117、負(fù)菌VKPM F-208）進(jìn)行多次誘變，得到正負(fù)高產(chǎn)菌株（正菌CPA1、負(fù)菌CMA3和CMB2）。通過(guò)配對(duì)發(fā)酵，正菌CPA1與負(fù)菌CMA3配對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量為7.2 g/L，正菌CPA1與負(fù)菌CMB2配對(duì)的發(fā)酵產(chǎn)量為6.8 g/L；隨后通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平最高達(dá)到9.0 g/L。在國(guó)內(nèi)，任雙喜等[18]采用UV、NTG和離子束對(duì)三孢布拉氏霉菌負(fù)菌N-1孢子進(jìn)行綜合誘變處理處理，獲得三孢布拉氏霉菌優(yōu)良負(fù)菌株（SCB201）。通過(guò)與正菌（SCB200）進(jìn)行配對(duì)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，誘變高產(chǎn)菌株的β-胡蘿卜素發(fā)酵水平達(dá)到2.0 g/L，比出發(fā)菌株發(fā)酵水平（0.2 g/L）提高9倍。

根據(jù)以上的相關(guān)研究報(bào)道分析可知，盡管目前可以有效引起生物物種遺傳物質(zhì)產(chǎn)生變異的化學(xué)誘變劑多種多樣，但由于部分誘變劑屬于劇毒化學(xué)品，危害以及監(jiān)管難度較大（例如二氯二乙烷、疊氮化鈉等），無(wú)法作為常規(guī)的誘變劑進(jìn)行使用。在長(zhǎng)期的三孢布拉氏霉菌選育工作中，NTG、EMS和亞硝酸等化學(xué)誘變劑由于使用安全性略高（國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)2A類(lèi)致癌物，http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/），因此成為該領(lǐng)域主要的化學(xué)誘變手段。其中，NTG更是實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中最為有效和常用的化學(xué)誘變劑。隨著近年來(lái)對(duì)于公共安全、勞動(dòng)衛(wèi)生和安全防護(hù)等意識(shí)的日益提升，類(lèi)似NTG等高效化學(xué)誘變劑的實(shí)驗(yàn)操作防護(hù)、使用和后處理方面的監(jiān)管也應(yīng)不斷加大?；贜TG等化學(xué)誘變劑對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員身體健康威脅的考慮，需要在實(shí)驗(yàn)防護(hù)、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中廢棄物處理、以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程的管理等方面提出嚴(yán)格規(guī)范的規(guī)程，從而更好地發(fā)揮化學(xué)誘變技術(shù)在生物物種誘變選育中的作用。

1.2.2 物理誘變技術(shù)及在三孢布拉氏霉菌組合誘變中的應(yīng)用

與化學(xué)誘變技術(shù)相比，物理誘變技術(shù)由于不存在誘變劑的殘留問(wèn)題，因而極大方便了誘變后的篩選和選育操作。目前主要應(yīng)用于三孢布拉氏霉菌株選育的物理誘變技術(shù)有：UV誘變、60Co輻照誘變、離子束誘變等。

UV誘變技術(shù)是一種極為簡(jiǎn)便且易于推廣的物理誘變技術(shù)。例如，顧秋亞[19]采用傳統(tǒng)的UV誘變方法，并利用含有0.025%洛伐他汀和0.05% OP乳化劑的抗性平板對(duì)三孢布拉氏霉菌負(fù)菌進(jìn)行定向選育，從而得到一株高產(chǎn)β-胡蘿卜素的菌株，其產(chǎn)量為2.06 g/L，比原始菌株提高了49.3%。另外，由于UV主要通過(guò)引起DNA大分子中相鄰的嘧啶形成二聚體，因此主要造成點(diǎn)突變或者局部的DNA分子損傷，加之生物體細(xì)胞內(nèi)具有多種針對(duì)DNA點(diǎn)突變損傷的修復(fù)機(jī)制，因此該方法的實(shí)際誘變效率較低。在β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的誘變選育工作中，該方法多以組合應(yīng)用的形式，應(yīng)用于三孢布拉霉孢子的誘變處理操作中（詳見(jiàn)1.2.1節(jié)）。

除UV誘變技術(shù)之外，常見(jiàn)用于三孢布拉氏霉誘變處理的物理誘變技術(shù)還包括：60Co輻照以及離子束處理誘變技術(shù)等。該類(lèi)方法主要是以γ射線以及高能的快中子（10～100 keV）對(duì)三孢布拉氏霉孢子中的DNA分子造成大范圍的損傷，從而引起遺傳物質(zhì)的缺失和重排[20]。童海寶等[21]曾使用60Co輻照等誘變技術(shù)對(duì)三孢布拉氏霉菌進(jìn)行了誘變處理，并取得良好的誘變效果。

離子束誘變技術(shù)在我國(guó)最早于1997年由中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所建立，并由邵春林等對(duì)離子束輻照引起的生物效應(yīng)，從能量、質(zhì)量、電荷三方面建立了協(xié)同效應(yīng)模型（EMC模型）[22]。對(duì)于該技術(shù)在生物物種改良中的應(yīng)用及研究進(jìn)展，周長(zhǎng)芳、張寧等[20-23]皆曾進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的論述。國(guó)內(nèi)利用離子束技術(shù)對(duì)三孢布拉氏霉菌進(jìn)行選育的研究，最早見(jiàn)于任雙喜等[18]的相關(guān)報(bào)道（詳見(jiàn)1.2.1節(jié)）；除此之外，張寧等[24]也以10 keV的低能氮離子（N+）注入三孢布拉氏霉菌孢子，并篩選得到兩株改良菌株。突變株的β-胡蘿卜素發(fā)酵水平達(dá)到2.2 g/L，比出發(fā)菌株提高20%。隨后，Zhang Ning等[25]又對(duì)三孢布拉氏霉負(fù)菌CK03孢子進(jìn)行低能氮離子注入誘變選育，獲得兩株優(yōu)良性狀的菌株（BH3-701和BH3-728），突變株的β-胡蘿卜素發(fā)酵水平從1.835 g/L分別提升至3.280 g/L和3.021 g/L。

此后，Zhang Ning等[26]從抗氧化酶酶活水平上，對(duì)低能離子束劑量與三孢布拉氏霉菌孢子存活率之間的關(guān)系進(jìn)行了解析，初步證實(shí)孢子極可能借助過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶對(duì)自由基的清除，降低離子束輻照對(duì)孢子的損傷。該研究結(jié)果為改進(jìn)離子束在誘變中的應(yīng)用起到重要的指導(dǎo)作用[27]。

1.2.3 原生質(zhì)體技術(shù)在三孢布拉氏霉菌選育中的應(yīng)用

由于三孢布拉氏霉菌細(xì)胞及其孢子具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁和孢子壁結(jié)構(gòu)，因此為細(xì)胞抵御化學(xué)誘變劑提供了一個(gè)天然的“屏障”。有效地去除三孢布拉氏霉菌細(xì)胞壁和孢子壁，可以提高菌體細(xì)胞遺傳物質(zhì)對(duì)物理和化學(xué)誘變劑的敏感性，有可能獲得意想不到的誘變效果。

早在1999年，單志萍等[28]就曾對(duì)三孢布拉氏霉原生質(zhì)體的制備及再生技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。通過(guò)利用溶壁酶、纖維素酶和蝸牛酶進(jìn)行組合優(yōu)化，使得原生質(zhì)體制備濃度達(dá)到8.0×106個(gè)/mL；隨后，借助于原生質(zhì)體液體再生技術(shù)，使得原生質(zhì)體再生率達(dá)到40%。2002年，該課題組又利用高濃度NTG（100 μg/mL）對(duì)三孢布拉氏霉JMβ817孢子進(jìn)行處理，從而得到功能上為單核的孢子，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行原生質(zhì)體的制備。通過(guò)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行UV誘變處理和再生，得到深黃色的突變株。其β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到2.36 g/L，比出發(fā)菌株提高了30%[29]。2007年，鄔春艷[30]通過(guò)三孢布拉氏霉菌原生質(zhì)體的制備，并利用UV誘變以及原生質(zhì)體融合技術(shù)，從而獲得1株具有優(yōu)良遺傳穩(wěn)定性的重組菌株。

除此之外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用原生質(zhì)體制備技術(shù)，也對(duì)三孢布拉氏霉菌的基因工程研究進(jìn)行了大量的研究探索。2008年，Li Ye等[31]利用蝸牛酶、纖維素酶和溶菌酶進(jìn)行復(fù)配，成功制備了三孢布拉氏霉菌原生質(zhì)體。原生質(zhì)體制備濃度為7.48×106個(gè)/mL，再生效率達(dá)到（77.5±2.70）%?；谠|(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，外源GFP編碼基因的表達(dá)以及RNA干擾技術(shù)相繼在三孢布拉氏霉體系得以實(shí)現(xiàn)。2011年，黃瓊瑤[32]又嘗試?yán)迷|(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）β-胡蘿卜素羥化酶基因（crt-Z）和酮化酶基因（crt-W）在三孢布拉氏霉中的表達(dá)。但由于原生質(zhì)體再生效率較低（制備效率約為2.2×106個(gè)/mL），因此該法的應(yīng)用效果與農(nóng)桿菌及基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法尚有一定的差距。

由此可見(jiàn)，雖然各課題組制備三孢布拉氏霉菌原生質(zhì)體的制備效率皆達(dá)到相同的技術(shù)水平，原生質(zhì)體的再生效率水平卻高低不一，原生質(zhì)體技術(shù)在三孢布拉氏霉菌菌種選育的應(yīng)用尚屬起步探索階段。系統(tǒng)的開(kāi)展原生質(zhì)體制備及其對(duì)再生效率影響的研究，提高所獲原生質(zhì)體的存活率，將是推動(dòng)該技術(shù)在三孢布拉氏霉菌育種與代謝工程相關(guān)研究的重要發(fā)展方向之一。

根據(jù)三孢布拉氏霉菌誘變選育技術(shù)的研究報(bào)道分析可知，該領(lǐng)域的發(fā)展方向除不斷嘗試和開(kāi)發(fā)各類(lèi)誘變技術(shù)外，其應(yīng)用過(guò)程更以NTG化學(xué)誘變?yōu)橹饕侄危⒁源诵纬筛黝?lèi)物理和化學(xué)誘變技術(shù)組合應(yīng)用的發(fā)展特點(diǎn)。由于三孢布拉氏霉菌為多核真菌的特點(diǎn)，通過(guò)較高的誘變劑量（例如NTG使用的濃度劑量），可以通過(guò)提高孢子致死率的方式，破壞大多數(shù)細(xì)胞核維持細(xì)胞正常生理代謝的功能[6,16]，并以此確保突變株的遺傳穩(wěn)定性。如能在分子水平上揭示三孢布拉氏霉菌生長(zhǎng)及孢子形成過(guò)程中的細(xì)胞核復(fù)制及調(diào)控基本規(guī)律，通過(guò)基因工程或者各類(lèi)調(diào)控手段獲取單核或者少核的菌株孢子，將對(duì)三孢布拉氏霉菌的誘變育種工作產(chǎn)生積極的促進(jìn)作用。

1.3 三孢布拉氏霉菌選育過(guò)程中高效篩選技術(shù)的應(yīng)用

選擇性培養(yǎng)基是一類(lèi)根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，從而提高特殊功能菌株的篩選效率。早在1995年的專(zhuān)利中，F(xiàn)inkelstein等[14]就曾建議，通過(guò)在固體培養(yǎng)基中添加抗高膽固醇藥物（例如：洛伐他?。⒖垢哐幬?、乙酰輔酶A合成抑制劑、類(lèi)胡蘿卜素合成抑制劑、類(lèi)異戊二烯合成抑制劑、自由基產(chǎn)生劑（例如杜醌）以及β-紫羅蘭酮等，皆能起到定向篩選β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的作用。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[33-35]，洛伐他汀是篩選β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株常用的抑制劑。由于洛伐他?。ㄓ绕涫瞧渌夂蟮乃嵝越Y(jié)構(gòu)）是羥甲基戊二酰CoA（HMG-CoA）結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，因此可以通過(guò)底物抑制效應(yīng)而降低羥甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）的酶活力，從而降低膽固醇生物合成，甚至干擾脂肪代謝，以致影響細(xì)胞正常生理代謝。通過(guò)誘變處理，部分突變株HMGR的編碼基因由于發(fā)生突變，從而可能解除HMG-CoA及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物對(duì)HMGR的抑制作用，因此能在含有洛伐他汀的培養(yǎng)基中得以存活。另外，突變株由于不再受HMG-CoA的抑制，因而β-胡蘿卜素合成的代謝通量得到顯著提高。國(guó)內(nèi)顧秋亞[19]、劉海麗[12]等也曾將該技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用，并取得良好的篩選效果。

在本實(shí)驗(yàn)室研究中發(fā)現(xiàn)，隨著對(duì)三孢布拉氏霉菌進(jìn)行不斷的選育，突變株甚至能夠在高濃度洛伐他?。ǜ哌_(dá)2 g/L）環(huán)境下正常生長(zhǎng)。推究該現(xiàn)象可能系突變株的HMGR在長(zhǎng)期的誘變篩選過(guò)程中，逐步降低甚至完全喪失對(duì)洛伐他汀的敏感性；甚至有可能借助耐藥機(jī)制的產(chǎn)生，而使突變株對(duì)洛伐他汀產(chǎn)生耐藥性。基于β-胡蘿卜素合成過(guò)程中有多種酶參與其合成代謝，因此充分了解相關(guān)酶的表達(dá)調(diào)控及構(gòu)效機(jī)制，針對(duì)不同酶開(kāi)發(fā)并合理選擇新型高效抑制劑進(jìn)行組合運(yùn)用，可以利用定向進(jìn)化[36]以及核糖體工程[37]等技術(shù)強(qiáng)化β-胡蘿卜素合成代謝通量，以取得良好的選育效果。

2 三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素工藝的優(yōu)化

三孢布拉氏霉菌作為目前生產(chǎn)β-胡蘿卜素的主要工業(yè)菌株，國(guó)外早在20世紀(jì)50年代就開(kāi)始對(duì)該過(guò)程工藝進(jìn)行系統(tǒng)的研究[38]。有關(guān)三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究，按照反應(yīng)器的類(lèi)型分為：搖瓶、攪拌槳式反應(yīng)器以及氣升式反應(yīng)器發(fā)酵；如按照發(fā)酵培養(yǎng)方式，主要以批次發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵為主。根據(jù)三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素工藝的特點(diǎn)，科研工作者對(duì)接種方式、培養(yǎng)基組分、發(fā)酵工藝參數(shù)和反應(yīng)器進(jìn)行了系統(tǒng)的研究和探索，并逐步開(kāi)發(fā)出符合工業(yè)化生產(chǎn)要求的工藝，使得β-胡蘿卜素的發(fā)酵生產(chǎn)水平以及過(guò)程經(jīng)濟(jì)性得到不斷的提高。

2.1 三孢布拉氏霉菌正負(fù)菌接種方式的研究進(jìn)展

無(wú)性孢子的形成和萌發(fā)、菌絲體的斷裂和生長(zhǎng)、以及接合孢子的形成和萌發(fā)是三孢布拉氏霉菌主要的細(xì)胞增殖方式[8]?；谌卟祭厦咕纳砗痛x特點(diǎn)，通過(guò)將正負(fù)菌分別進(jìn)行無(wú)性培養(yǎng)，并在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行混合配對(duì)，可以有效提高對(duì)發(fā)酵過(guò)程中正負(fù)菌比例的控制，從而實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素的高水平發(fā)酵需求。針對(duì)該菌株特殊的生理和代謝特點(diǎn)，早在20世紀(jì)60年代，國(guó)外科學(xué)家就已經(jīng)開(kāi)始對(duì)三孢布拉氏霉菌種子液制備及接種方式進(jìn)行系統(tǒng)的研究，并不斷對(duì)不同的研究目的發(fā)展出各具特色的工藝類(lèi)型。

2.1.1 利用斜面培養(yǎng)物分別制備三孢布拉氏霉菌正負(fù)菌種子液

早期β-胡蘿卜素發(fā)酵所需種子液，以接種正負(fù)菌株斜面培養(yǎng)物的方式進(jìn)行制備。Ciegler等[38]通過(guò)將NRRL2456（正菌）和NRRL2457（負(fù)菌）斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，并分別按照5%的接種量實(shí)現(xiàn)兩菌株的混合發(fā)酵。隨后，Ciegler等[39]利用20 L發(fā)酵罐開(kāi)展β-胡蘿卜素發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵種子液制備方法及接種操作會(huì)對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵水平產(chǎn)生不同程度的影響。其中，將正負(fù)菌株種子液分別直接接種發(fā)酵的工藝，其β-胡蘿卜素發(fā)酵水平明顯優(yōu)于正負(fù)菌種子液預(yù)混合孵育的發(fā)酵工藝。當(dāng)正菌與負(fù)菌接種體積比為1∶1（總接種量為10%）時(shí)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平最佳，但總接種量對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵水平無(wú)顯著影響。

對(duì)于搖瓶發(fā)酵而言，由于正負(fù)菌種子液的制備過(guò)程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)菌絲體相互纏繞形成較大的菌團(tuán)或者菌塊，因此較小體積規(guī)模的發(fā)酵很難實(shí)現(xiàn)接種時(shí)的均勻定量控制。為解決該問(wèn)題，Dandekar等[40]分別將三孢布拉氏霉菌正負(fù)菌的斜面培養(yǎng)物接種于含有10 g/L麥芽汁的種子培養(yǎng)基中，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)得到的正負(fù)菌菌絲體分別進(jìn)行均質(zhì)分散，以此作為批量搖瓶發(fā)酵的種子液。通過(guò)該方法，Dandekar等證實(shí)環(huán)腺苷酸參與了三孢布拉氏霉菌三孢酸和β-胡蘿卜素的合成、菌體生長(zhǎng)、繁殖以及菌體形態(tài)發(fā)育等諸多生理代謝過(guò)程的調(diào)控，但種子液均質(zhì)對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵的影響卻并未見(jiàn)詳盡的報(bào)道。

2.1.2 三孢布拉氏霉菌孢子接種分別制備正負(fù)菌種子液

與接種斜面培養(yǎng)物制備發(fā)酵所需種子液的方法相比較，孢子由于分散均勻且可以通過(guò)顯微技術(shù)等方法進(jìn)行快速定量，因此有利于菌種接種的定量控制。2006年B?hme等[41]發(fā)現(xiàn)，正菌孢子萌發(fā)時(shí)間遲緩于負(fù)菌孢子，但后期正菌菌絲體生長(zhǎng)速度卻明顯快于負(fù)菌?；谠摤F(xiàn)象，該研究組對(duì)正負(fù)菌種子液的培養(yǎng)時(shí)間以及合適的接種菌齡進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。當(dāng)孢子接種量約為1.7×103個(gè)/mL時(shí)，種齡為20 h的負(fù)菌種子液與種齡為24 h的正菌種子液適宜接種發(fā)酵。當(dāng)正負(fù)菌種子液以1∶30的體積比進(jìn)行配對(duì)發(fā)酵時(shí)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平最佳，達(dá)到0.45 mg/L。潘鵬等[42]利用正負(fù)菌株孢子懸浮液進(jìn)行種子液制備時(shí)也發(fā)現(xiàn)，正菌細(xì)胞量增長(zhǎng)速率顯著快于負(fù)菌，正負(fù)菌種子液適宜接種的種齡分別為12～15 h和25～30 h。通過(guò)接種量和接種比例的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，正負(fù)菌種子液接種總量為20%，且體積比控制在2∶3時(shí)，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平最佳，達(dá)到12.2 mg/L。

2.1.3 三孢布拉氏霉菌正負(fù)菌孢子混合直接接種發(fā)酵

有關(guān)直接以正負(fù)菌株孢子混合接種發(fā)酵的方法，Kim等[43-44]于1997年曾對(duì)此進(jìn)行了應(yīng)用。該課題組以1×105個(gè)/mL孢子接種量，直接將正負(fù)菌株的孢子接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（250 mL搖瓶），并對(duì)司盤(pán)、吐溫和曲拉通3 類(lèi)表面活性劑進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，司盤(pán)-20對(duì)β-胡蘿卜素以及三孢布拉氏霉菌合成中間代謝物三孢酸皆具有較好的促進(jìn)作用，發(fā)酵水平可達(dá)2.3 g/L，比不含司盤(pán)-20的對(duì)照組提高2.7倍。隨后，該課題組通過(guò)接種5×106個(gè)正菌孢子和1×107個(gè)負(fù)菌孢子，系統(tǒng)研究了H2O2對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10 μmol/L的H2O2，可以使菌絲體中的β-胡蘿卜素含量比對(duì)照組提高約46%[45]。由于孢子直接接種操作簡(jiǎn)單，兼之搖瓶發(fā)酵體積較小，因此該方法極大地提高了工作效率，適宜于對(duì)大量的實(shí)驗(yàn)考察因素進(jìn)行快速的篩選判別。

綜上所述，三孢布拉氏霉菌發(fā)酵種子液的擴(kuò)大培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)室研究成果向工業(yè)化生產(chǎn)逐步放大中必須面對(duì)的技術(shù)環(huán)節(jié)，其研發(fā)歷程呈現(xiàn)如下特點(diǎn)：種子液接種方式從簡(jiǎn)單的斜面培養(yǎng)物直接接種，逐步發(fā)展到精確定量接種孢子；而發(fā)酵接種控制則從簡(jiǎn)單的體積混合配比，逐步強(qiáng)化至根據(jù)菌齡和菌體濃度和菌體濃度進(jìn)行接種量和接種比例的定量控制。

由于曾有報(bào)道三孢布拉氏霉菌負(fù)菌孢子無(wú)法進(jìn)行大量的制備[46]，加之工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵需要大量的種子液以滿足大規(guī)模發(fā)酵制備的需求，因而定量接種孢子并對(duì)無(wú)性培養(yǎng)的正負(fù)菌種子液進(jìn)行逐級(jí)放大的工藝，則是三孢布拉氏霉菌接種控制及種子液制備的主要方法。另外，由于其他接種和種子液制備方法具有操作簡(jiǎn)便等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，因此通過(guò)對(duì)其進(jìn)行不斷的完善和改進(jìn)，亦可使其在諸如菌種選育與發(fā)酵培養(yǎng)基篩選等特定研究工作中發(fā)揮獨(dú)特的作用。

2.2 三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素培養(yǎng)基優(yōu)化的研究進(jìn)展

培養(yǎng)基種類(lèi)和組成是實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素發(fā)酵的基本條件之一，其中碳源、氮源以及油脂是三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素用量最大，生產(chǎn)成本所占比重最高的3種培養(yǎng)基組分。通過(guò)對(duì)主要培養(yǎng)基組分進(jìn)行篩選以及優(yōu)化，是提高β-胡蘿卜素發(fā)酵水平，并降低生產(chǎn)成本的常用手段。

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源和氮源的篩選和優(yōu)化

碳源和氮源是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中能量供應(yīng)以及合成細(xì)胞物質(zhì)的重要原料，其中碳源更是合成β-胡蘿卜素的主要原料。早在20世紀(jì)50年代，Ciegler等[38]就曾以各類(lèi)谷物及其加工副產(chǎn)品作為碳氮源進(jìn)行β-胡蘿卜素的發(fā)酵研究。近年來(lái)，Choudhari等[47]亦曾對(duì)各種常見(jiàn)的碳源進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的比較，其中以60 g/L葡萄糖作為碳源時(shí)，β-胡蘿卜發(fā)酵效果最佳。另?yè)?jù)研究報(bào)道[24]，以玉米淀粉替代葡萄糖進(jìn)行進(jìn)行β-胡蘿卜素發(fā)酵，可以取得更好的應(yīng)用效果；但基于發(fā)酵成本的考慮，玉米粉可能具有較好的應(yīng)用潛力。除此之外，也有研究者嘗試使用一些廉價(jià)的碳源，如甜菜或甘蔗廢糖蜜[48]、工業(yè)甘油[49]、以及制糖、奶酪和乳品制造行業(yè)的工業(yè)廢水[50]等生產(chǎn)β-胡蘿卜素。近年來(lái)，隨著基于糖平臺(tái)生物煉制過(guò)程的不斷發(fā)展，從自然界尋找更為廉價(jià)的碳源已成為可能，這也為提高β-胡蘿卜素發(fā)酵過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性指標(biāo)提供新的契機(jī)。

據(jù)研究報(bào)道[51-54]，黃豆粉是目前β-胡蘿卜素發(fā)酵最為常用的氮源。近年來(lái)，張寧等[24]研究發(fā)現(xiàn)，豆粕和棉籽蛋白亦皆具有較好的應(yīng)用效果，其中又以30 g/L棉籽蛋白對(duì)菌體和β-胡蘿卜發(fā)酵促進(jìn)效果最佳。雖然，Choudhari等[47]研究指出，在其考察的氮源中，1 g/L的酵母提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)以及β-胡蘿卜發(fā)酵促進(jìn)作用最佳，其次為大豆蛋白胨和牛肉蛋白胨，而相同條件下豆粕的影響幾乎可以忽略不計(jì)。但由于酵母提取物營(yíng)養(yǎng)成分豐富，因此經(jīng)常被用作微生物生長(zhǎng)因子的重要來(lái)源，但由于其價(jià)格較高，因此常以玉米漿作為其替代物。Goksungur等[55]的研究表明，50 g/L的玉米漿可以有效替代1.0 g/L酵母提取物應(yīng)用于β-胡蘿卜發(fā)酵。

由于三孢布拉霉菌高效發(fā)酵制備β-胡蘿卜是基于菌體的大量繁殖以及β-胡蘿卜大量累積的過(guò)程，因此合理的平衡培養(yǎng)基中的碳氮源組成，確保合理的生物量，可以避免碳源和氮源的無(wú)效消耗，提高培養(yǎng)基成分向β-胡蘿卜的轉(zhuǎn)化效率。另外，鑒于三孢布拉霉菌發(fā)酵制備β-胡蘿卜的培養(yǎng)基組分通常為各類(lèi)谷物，其中包括了大量的植物蛋白和多糖成分。為了快速的利用這些大分子化合物，三孢布拉霉菌除需要利用碳氮源合成細(xì)胞物質(zhì)之外，還要合成大量的水解酶，以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基成分的充分利用。合理的選擇培養(yǎng)基組分，并對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，將可以有效的提高培養(yǎng)基中大分子物質(zhì)的利用速率，同時(shí)亦可提高原料的轉(zhuǎn)化效率。

2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基植物油脂成分的篩選和優(yōu)化

三孢布拉氏霉菌發(fā)酵β-胡蘿卜素的過(guò)程中，植物油的添加可以為細(xì)胞的合成代謝提供額外的大量能量和碳骨架，同時(shí)亦可作為前體物質(zhì)用于β-胡蘿卜素的合成代謝。而葡萄糖作碳源，盡管也可以轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸參與β-胡蘿卜素的生物合成，但大部分通過(guò)三羧酸循環(huán)而參與能量代謝。

近幾年，張寧[24]、顧秋亞[56]、Choudhari[57]和Papaioannou[58]等曾分別系統(tǒng)比較了棉籽油、大豆油、亞油酸、葵花籽油、橄欖油、棕櫚油、玉米油、葵花油和花生油對(duì)三孢布拉氏霉菌生長(zhǎng)以及β-胡蘿卜素合成的影響。在所考察各類(lèi)植物油中，最常用的為棉籽油和大豆油，其中又以棉籽油對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵的促進(jìn)效果最佳[56]。張寧[24]、Papaioannou[58]等研究表明，在其考察的植物油脂中，大豆油和橄欖油對(duì)菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最佳，而棉籽油以及含有較高亞麻酸的葵花籽油最有利于β-胡蘿卜素的發(fā)酵。然而Choudhar等[57]卻研究發(fā)現(xiàn)，30%葵花籽油和橄欖油雖然可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但對(duì)β-胡蘿卜素合成卻有抑制作用；而棕櫚油、橄欖油和玉米油雖然能獲得良好的生物量，然而β-胡蘿卜素發(fā)酵得率較低。在其所考察植物油脂中，以大豆油對(duì)β-胡蘿卜素促進(jìn)效果最佳。廖春麗等[59]利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)曾發(fā)現(xiàn)，在其考察的濃度范圍內(nèi)，檸檬酸、黃豆粉氮源和棉籽油相互間存在交互作用，并最終影響菌株的β-胡蘿卜素發(fā)酵水平。不同課題組研究之間的巨大差異，可能與發(fā)酵所用的菌株或者培養(yǎng)基組成及其含量的差異有關(guān)。

雖然植物油的存在提高了真菌的生物量和類(lèi)胡蘿卜素的含量，但是培養(yǎng)基中植物油濃度偏高，亦會(huì)增加發(fā)酵液的黏稠度，從而影響搖瓶?jī)?nèi)的溶氧水平和菌體對(duì)底物的吸收利用[39]。另?yè)?jù)研究報(bào)道[56]，油脂有可能通過(guò)將細(xì)胞中的β-胡蘿卜素溶解，從而部分解除產(chǎn)物抑制，提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。

2.2.3 發(fā)酵促進(jìn)劑對(duì)β-胡蘿卜素生物合成的影響

在三孢布拉氏霉發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件已確定，加入一些發(fā)酵促進(jìn)劑可以影響β-胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶活性，通過(guò)對(duì)代謝途徑的調(diào)控，從而有效提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量；表面活性劑的加入有利于菌體對(duì)培養(yǎng)基中植物油的利用；抗氧化劑的存在則可以避免已經(jīng)生成的β-胡蘿卜素被氧化。

2.2.3.1 類(lèi)胡蘿卜素的前體及結(jié)構(gòu)類(lèi)似物

類(lèi)胡蘿卜素的前體及結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，如β-紫羅酮[38]及其替代原料如苧烯、檸檬油、芳香族化合物[60]。β-紫羅酮可激活生物合成途徑中的甲羥戊酸激酶，該酶是胡蘿卜素生物合成途徑中主要的限速酶。通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)β-紫羅酮的補(bǔ)加，能有效地提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量[61-62]。劉月英等[63]在研究紅酵母COS-5產(chǎn)胡蘿卜素工藝時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)添加鹽酸硫胺素、橘子皮汁（含紫羅酮）、蕃茄汁（含八氫蕃茄紅素和四氫蕃茄紅素等β-胡蘿卜素和其他類(lèi)胡蘿卜素的前體），均對(duì)該菌生物合成β-胡蘿卜素有促進(jìn)作用。顧秋亞等[56]研究了不同代謝促進(jìn)劑對(duì)三孢布拉氏霉菌菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物代謝的影響，其中，β-紫羅酮效果最佳，但由于其對(duì)早期的菌體生長(zhǎng)具有毒性，故最佳補(bǔ)加時(shí)間為菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后。

另外，一些化學(xué)添加劑能夠影響很多微生物類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生。Tang Qiong等[64]研究了麥角甾醇合成抑制劑-酮康唑?qū)θ卟祭厦筯mgR基因和carRA基因轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果顯示，酮康唑觸發(fā)了hmgR基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高了β-胡蘿卜素和輔酶Q10的含量。研究發(fā)現(xiàn)[65]基因carB與carRA是β-胡蘿卜素的生物合成途徑的關(guān)鍵基因，一定濃度的花生四烯酸[53]能使hmgR、carRA、carB基因轉(zhuǎn)錄平提高，并使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高。

2.2.3.2 表面活性劑類(lèi)發(fā)酵促進(jìn)劑

由于發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了大量的植物油，為了更好地利用植物油，可以對(duì)其添加表面活性劑，利用表面活性劑的兩性改變微生物細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞表面的極性，使菌絲體分散比較均勻，從而進(jìn)一步改變菌絲體的生理學(xué)性質(zhì)和發(fā)酵液的流變性，刺激菌體生長(zhǎng)與呼吸；同時(shí)，表面活性劑的乳化作用可以提高菌體的脂肪酶活性，促進(jìn)菌體對(duì)植物油的分解和利用，最終提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量[52]。

研究發(fā)現(xiàn)，在三孢布拉氏霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定濃度的Span-20[43-44]，OP乳化劑或吐溫[52]均能有效的提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量。大豆卵磷脂是一種兩性表面活性劑，研究發(fā)現(xiàn)[62,66]，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加大豆卵磷脂可以提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，并有效降低γ-胡蘿卜素的產(chǎn)量，使目標(biāo)產(chǎn)物更趨集中。

2.2.3.3 三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物類(lèi)發(fā)酵促進(jìn)劑

三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物在有氧代謝中發(fā)揮著重要作用，形成微生物類(lèi)胡蘿卜素的碳架。在培養(yǎng)基中添加一定量的檸檬酸和蘋(píng)果酸，能夠刺激類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生[67]。王常玲等[66]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期加入檸檬酸可以促進(jìn)菌體的初級(jí)代謝，增強(qiáng)菌體的呼吸作用，使三孢布拉氏霉菌的生物量增加很快，從而為大量生產(chǎn)β-胡蘿卜素提供基礎(chǔ)。

2.2.3.4 抗氧化劑類(lèi)發(fā)酵促進(jìn)劑

β-胡蘿卜素為類(lèi)萜化合物，其結(jié)構(gòu)含有許多雙鍵，因此對(duì)氧很敏感，可以考慮在發(fā)酵后期向發(fā)酵液中添加抗氧化劑保護(hù)已生成的β-胡蘿卜素。劉海麗等[52]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加的抗氧化劑乙氧喹為最佳濃度時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量增幅達(dá)70%。Nanou等[68]研究發(fā)現(xiàn)，三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素，加入20 mmol/L的抗氧化劑丁化羥基甲苯時(shí)，得到的類(lèi)胡蘿卜素為125 mg/g干菌體。

綜上所述，培養(yǎng)基組分篩選優(yōu)化的相關(guān)研究，由于考察對(duì)象多、實(shí)驗(yàn)工作量大，采用可靠的數(shù)學(xué)模型對(duì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以大大提高工作效率。尤其是有些培養(yǎng)基組分，很難用傳統(tǒng)的碳源、氮源以及富含生長(zhǎng)因子的組分進(jìn)行清晰的界定，更不宜用簡(jiǎn)單的濃度均一考察或者碳氮含量歸一處理進(jìn)行組分的篩選。令人鼓舞的是，在近年來(lái)的研究工作中，除單因素考察法之外[47]，部分因子設(shè)計(jì)[69]、中心復(fù)合設(shè)計(jì)[70]、中心復(fù)合設(shè)計(jì)與均一精密[47]、遺傳算法[71]以及響應(yīng)面分析[47,70]等數(shù)學(xué)工具的大量應(yīng)用，不僅方便了對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基多組分的全局優(yōu)化及組分間交互作用的分析，而且有效促進(jìn)了培養(yǎng)基組分優(yōu)化等研究工作的高效開(kāi)展。

2.3 三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素過(guò)程工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素影響的研究

溫度可以通過(guò)影響各種酶反應(yīng)的速率，從而改變菌體內(nèi)各代謝途徑的通量，并以此最終影響產(chǎn)物的合成速率甚至微生物的代謝方向。低溫時(shí)微生物從環(huán)境中攝取營(yíng)養(yǎng)的速率下降，同時(shí)代謝活動(dòng)減弱，如蛋白合成速率也下降，生物膜功能被干擾；而類(lèi)胡蘿卜素量的增加和脂類(lèi)的不飽和化都是對(duì)低溫時(shí)生物膜功能減弱的補(bǔ)償[67]。有研究表明，在28～30℃發(fā)酵將會(huì)增加β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素的含量，而產(chǎn)生番茄紅素的最佳溫度為25℃[47,72]。

2.3.2 發(fā)酵液pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素影響的研究

pH值的變化與培養(yǎng)基的組分尤其是碳氮比有很大的關(guān)系。在三孢布拉氏霉搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，隨著細(xì)胞對(duì)葡萄糖的快速吸收利用，二氧化碳的釋放和有機(jī)酸的生成，導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值很快下降到較酸的水平，隨后緩慢上升，到發(fā)酵終止時(shí)pH值達(dá)到最高，可能是由于細(xì)胞的死亡、溶解導(dǎo)致胺代謝產(chǎn)物的釋放造成的[73]。Mantzouridou等[70]研究了在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同初始pH值（6.0～11.0）對(duì)細(xì)胞生物量和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，在pH值為7.0時(shí)獲得的β-胡蘿卜素（170.0 mg/L）為最高。Choudhari等[47]研究了初始pH 4.0～10.0的培養(yǎng)基對(duì)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量影響，在pH 6～7獲得較高的產(chǎn)量為（99±1）mg/L。Kim等[74]則發(fā)現(xiàn)，利用堿性培養(yǎng)基（培養(yǎng)基滅菌前的初始pH值為10.0）可以得到較高的β-胡蘿卜素產(chǎn)量。由于未對(duì)滅菌前后的培養(yǎng)基組分以及pH值變化進(jìn)行分析，因此較難以推斷高pH值對(duì)β-胡蘿卜素合成的促進(jìn)作用機(jī)理。通常情況下，糖分在高溫及高pH值條件下其穩(wěn)定性較差，但高pH值和高溫環(huán)境可能有利于培養(yǎng)基中蛋白成分的水解，從而有利于菌體的生長(zhǎng)利用。因此，如果能夠通過(guò)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（例如接種前調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值）以及發(fā)酵過(guò)程中的pH值和組分分析監(jiān)控，將有助于得到更為確切可靠的研究結(jié)論。

2.3.3 溶解氧對(duì)發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素影響的研究

在搖瓶培養(yǎng)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速固定的前提下，裝液量的變化決定著培養(yǎng)基中溶解氧濃度的高低，從而影響細(xì)胞對(duì)氧的需求，而發(fā)酵罐中則可以通過(guò)提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氧量來(lái)改善。Nanou等[75]發(fā)現(xiàn)，在250 mL錐形瓶中放入25 mL培養(yǎng)基（氣液相體積比為9.0）時(shí)，可使類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到最大115 mg/g干生物量；但是繼續(xù)提高溶解氧水平至15.7（即氣液相體積比為15.7）時(shí)，有可能極高濃度的活性氧會(huì)引起三孢布拉氏霉的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素的含量下降。另有研究結(jié)果表明[76]，發(fā)酵液中的菌絲球在較高的溶氧環(huán)境下會(huì)解體形成分散的菌絲體，從而有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳遞和利用，以此提高β-胡蘿卜素的發(fā)酵水平。

除增加氧氣的供應(yīng)之外，添加氧載體也可提高同一反應(yīng)系統(tǒng)的傳氧系數(shù)。有研究表明，通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中加入攜帶大量氧氣的乳化植物油，可以有效的提高β-胡蘿卜素的發(fā)酵水平[77]。另有研究也系統(tǒng)考察了HO[45,78]、22液體石蠟[54]、正己烷和正十二烷[79]作為氧載體對(duì)β-胡蘿卜素合成的影響，發(fā)現(xiàn)以上氧載體在一定濃度下可刺激微生物的β-胡蘿卜素形成，高于此濃度，其毒性可導(dǎo)致β-胡蘿卜素產(chǎn)量大大下降。

2.3.4 發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素培養(yǎng)方式的研究進(jìn)展

對(duì)三孢布拉氏霉菌進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)，可達(dá)到很高的生物量和β-胡蘿卜素[80]，向發(fā)酵罐中通入純氧并間歇性補(bǔ)加葡萄糖，既可以控制罐中由于表面活性劑等產(chǎn)生的泡沫，合適的溶解氧濃度也利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成[73]。Nanou等[81]研究了在鼓泡床反應(yīng)器中通過(guò)提高通氣量誘導(dǎo)氧化壓力，并研究了三孢布拉氏霉菌的形態(tài)改變情況，在通氣量為4 vvm時(shí)，得到類(lèi)胡蘿卜素最高產(chǎn)量（55.0±2.5）mg/g干菌體，其中β-胡蘿卜素的含量占91.68%。Mantzouridou等[82]考察了在攪拌反應(yīng)釜中，通氣量和攪拌速度對(duì)三孢布拉氏霉菌的形態(tài)及發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響。在通氣量為1.5 vvm、葉輪轉(zhuǎn)速150 r/min條件下，β-胡蘿卜素最高質(zhì)量濃度達(dá)到1.5 kg/m3。Perez等[62]通過(guò)在發(fā)酵中期多次流加含10% β-紫羅酮的植物油，使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到8.7 g/L。許新德等[77]在三孢布拉氏霉菌發(fā)酵培養(yǎng)24 h后分批補(bǔ)加植物油，不僅保持了培養(yǎng)基黏度的均一性，還提高了植物油利用率，進(jìn)而促進(jìn)了三孢布拉氏霉的產(chǎn)能。

3 反應(yīng)器工程技術(shù)在三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)β--胡蘿卜素中的應(yīng)用

三孢布拉氏霉菌屬于高度好氧的微生物，在其發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中，由于培養(yǎng)基黏度大，固形物（包括大量生成的菌體）含量高，生長(zhǎng)過(guò)程中菌絲體容易糾結(jié)成團(tuán)，導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)的溶氧速率較低。在發(fā)酵罐中如若加大攪拌力度，則會(huì)造成菌絲體的損傷，使生產(chǎn)能力下降[73]。

在早期的研究中，童海寶等[83]曾通過(guò)使用上、中層為寬葉推進(jìn)式，下層為渦輪式的組合式攪拌槳葉，在提高了發(fā)酵液的傳質(zhì)性能和氣液接觸效率的同時(shí)，降低對(duì)菌絲體的剪切損傷，發(fā)酵水平達(dá)到2.0 g/L以上。另外，譚新國(guó)等[84]也系統(tǒng)比較了不同槳型的攪拌槳對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。在最佳攪拌形式下，β-胡蘿卜素發(fā)酵水平達(dá)到（1.547±0.305）g/L，比反應(yīng)器優(yōu)化前的發(fā)酵水平提高了5.05倍。

與攪拌型反應(yīng)器相比，升式反應(yīng)器可以利用通入的空氣引起氣液環(huán)流，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液的全混和攪拌，提高傳質(zhì)系數(shù)。在滿足生物量對(duì)高溶氧要求的同時(shí)，減小了剪切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的損傷，因此廣泛應(yīng)用于植物和絲狀真菌的發(fā)酵培養(yǎng)[85-87]。姜文侯等[88]通過(guò)應(yīng)用3 000 L氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)三孢布拉氏霉菌，實(shí)現(xiàn)了β-胡蘿卜素的發(fā)酵制備，在27℃發(fā)酵114 h，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到1.328 g/L。此外，Varzakakou等[87]通過(guò)利用1.4 L玻璃氣升式反應(yīng)器，對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵過(guò)程中的三孢布拉氏霉菌自溶機(jī)理進(jìn)行了探討，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)的水解酶酶活力分析發(fā)現(xiàn)，蛋白酶以及幾丁質(zhì)酶直接介導(dǎo)了該過(guò)程。

對(duì)于三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素過(guò)程而言，由于發(fā)酵液生物量大，加之該菌種典型的低等絲狀真菌，且β-胡蘿卜素為胞內(nèi)產(chǎn)物，因此對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中的物質(zhì)、能量和動(dòng)量傳遞提出了更高的要求。如能在反應(yīng)器尺度上針對(duì)該發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行針對(duì)系統(tǒng)的研究，將可以有效的挖掘菌株的生產(chǎn)潛能、提高過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性指標(biāo)。因此，新型反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，將不失為促進(jìn) 該領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展的重要研究方向。

4 結(jié) 語(yǔ)

在過(guò)去的半個(gè)多世紀(jì)里，三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究一直隨著生物工程和化工過(guò)程等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展而不斷深入。其中高通量菌種選育技術(shù)的開(kāi)發(fā)和代謝工程研究的不斷深入，將是獲取高效細(xì)胞工廠的重要研究方向。對(duì)三孢布拉氏霉菌生理和代謝等基礎(chǔ)研究的開(kāi)展，不僅能夠揭示三孢酸類(lèi)物質(zhì)生成及對(duì)β-胡蘿卜素合成的調(diào)控機(jī)理，而且有助于創(chuàng)造全新的細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)單一菌株的發(fā)酵過(guò)程。如能利用代謝工程等手段，使纖維素酶等外源基因通過(guò)三孢布拉氏霉菌進(jìn)行高效的分泌表達(dá)，更可能實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)纖維素等廉價(jià)碳源的直接利用。此外，通過(guò)對(duì)β-胡蘿卜素發(fā)酵過(guò)程工藝的優(yōu)化和強(qiáng)化控制，也為細(xì)胞工廠的有序運(yùn)行提供重要的物流保障。通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)各類(lèi)常用的培養(yǎng)基組分進(jìn)行科學(xué)系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，不僅可以獲得合理的培養(yǎng)基組分，而且通過(guò)經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理方式以及補(bǔ)料流加策略的優(yōu)化，亦可以強(qiáng)化對(duì)發(fā)酵過(guò)程菌株生長(zhǎng)及代謝的過(guò)程控制，提高β-胡蘿卜素發(fā)酵的效率?；诜磻?yīng)器尺度的生物發(fā)酵過(guò)程研究，是利用工程手段有效解決生物過(guò)程問(wèn)題的重要手段。通過(guò)新型反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和研發(fā)，不僅可以為三孢布拉霉菌的生長(zhǎng)以及β-胡蘿卜素的合成提供適宜的外在環(huán)境，更可能通過(guò)質(zhì)量和能量傳遞的改善，而使整個(gè)過(guò)程更為經(jīng)濟(jì)。

隨著人們對(duì)生活品質(zhì)的要求越來(lái)越高，以及對(duì)綠色天然產(chǎn)品的倡導(dǎo)，天然β-胡蘿卜素的市場(chǎng)需求將會(huì)越來(lái)越大。三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素作為生物化工領(lǐng)域一個(gè)典型的混合菌發(fā)酵過(guò)程，雖然有其本質(zhì)的缺陷，但也有其獨(dú)特的過(guò)程優(yōu)勢(shì)。相信在相關(guān)科研工作者的努力之下，該研究方向會(huì)不斷取得突破進(jìn)展，進(jìn)而建立起全新的發(fā)酵模式，并在其他高附加值產(chǎn)品的研發(fā)上綻放出新的生機(jī)和活力。

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