朱祥瑞，楊逸文，占鵬飛，章本學(xué)，沈建棟

（1.浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058；2.安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 湖州 313300；3.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 湖州 313060；4.湖州市南潯尚豪蠶桑專業(yè)合作社，浙江 湖州 313000）

提高白藜蘆醇含量的桑椹酒釀制方法

朱祥瑞1，楊逸文2，占鵬飛3，章本學(xué)2，沈建棟4

（1.浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058；2.安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 湖州 313300；3.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 湖州 313060；4.湖州市南潯尚豪蠶桑專業(yè)合作社，浙江 湖州 313000）

為了檢測額外添加桑椹果皮、3種不同酵母、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對于桑椹酒酒中白藜蘆醇含量的影響，以湖州市安吉縣的大10果桑為原料，進(jìn)行桑椹酒發(fā)酵。采用高效液相色譜（HPLC）對桑椹酒中白藜蘆醇進(jìn)行了檢測分析。結(jié)果表明：發(fā)酵到第4 d，處理A、B、C-1、C-2、C-3和CK發(fā)酵液中白藜蘆醇含量分別為2.5、3.9、4.3、4.5、4.5和2.7 mg/L；發(fā)酵時間從0 h至第96 h，白藜蘆醇含量逐漸升高，到96 h時為最高；在26～32℃條件下發(fā)酵時，白藜蘆醇含量均比較理想，但以28℃比較適宜。酵母對白藜蘆醇含量的影響不太有規(guī)律。

白藜蘆醇；含量；桑椹酒

白藜蘆醇（Resveratro1）是植物所含的一種天然的二苯乙烯類化合物，是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物。到目前為止，已證實白藜蘆醇只存在于21科31屬的72種植物中［1～2］，其資源并不是很豐富，因此挖掘和開發(fā)資源，是具有現(xiàn)實意義的工作。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明：白藜蘆醇具有抗病毒、抑腫瘤、抗氧化、清除自由基、抗誘變、降血脂、保護(hù)心血管、延緩衰老、美容等作用，是一種極具開發(fā)價值的天然物質(zhì)［3］，被喻為繼“紫杉醇”之后的又一新的綠色抗癌物質(zhì)。因而其在醫(yī)藥、保健食品領(lǐng)域具有很廣闊的開發(fā)前景。美國天然藥物研究所（CNN）研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇還具有抗艾滋病的作用。但目前從天然植物中提取的得率較低，因此研究有效的提取方法具有重要的意義。

桑椹釀制酒中含有一定量的白藜蘆醇，在桑椹酒釀制過程中，通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)處理，盡可能保留更多的白藜蘆醇是一項既有現(xiàn)實意義也有理論意義的工作。本試驗通過對釀制條件的控制和技術(shù)處理，使白藜蘆醇含量有所提高。試驗工作小結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

桑椹：大10成熟果實，2013年5月中旬采摘于安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司桑園。

桑椹果皮：2013年5月中旬采摘于安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司桑園的大10成熟果實，榨取果汁后的桑椹果皮。

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品：美國Sigma Chemical Co.，LTD產(chǎn)品。

乙腈：美國霍尼韋爾公司（Honeywell）色譜級產(chǎn)品。

酵母：①LAFFORT（拉氟德）F33，法國LAFFORT公司產(chǎn)品；②安琪釀酒酵母RW（葡萄酒專用酵母），安琪酵母股份有限公司；③安琪釀酒酵母SY（果酒專用酵母），安琪酵母股份有限公司。

果膠酶：法國LAFFORT果酒專用果膠酶。

1.2 儀器

LC-6A高效液相色譜儀、UV檢測器：日本島津公司。

色譜柱：Hypersil ODS柱（250 mm×416 mm，5 μm），美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

分析天平：賽多利斯BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品。

發(fā)酵罐：RAT-5型5 L雙層玻璃反應(yīng)釜，予華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品2.5 mg，用無水乙醇溶解并定容于25 ml容量瓶中。

分別吸取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液1.0、2.0、3.0、 4.0、5.0 ml，用無水乙醇定容于100 ml容量瓶中，搖勻，得濃度分別為1、2、3、4、5 mg/L白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)系列。以無水乙醇為空白對照，各進(jìn)樣10 μl，在306 nm波長下進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件：流動相：乙腈/水（35/65）；檢測波長：306 nm；柱溫：室溫；流速：1 ml/min；進(jìn)樣：10 μl。

以樣品白藜蘆醇量為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），計算曲線方程（n=5）和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.3.2 桑椹酒釀制方法

（1）酵母準(zhǔn)備：將LAFFORT F33酵母緩慢的加入到其10倍質(zhì)量的37℃的熱水中，攪拌溶解，活化，靜置2 min，備用。

（2）原料準(zhǔn)備：桑椹用機(jī)械破碎后，作以下不同處理：A：破碎后的桑椹，過濾，濾去果皮，取果汁用于釀酒；B：破碎后的桑椹，連果皮一起用于釀酒；C：破碎后的桑椹，連果皮一起用于釀酒，并添加一定比例的桑椹果皮（5%、10%和15%，果皮來自于處理A）一起釀酒。

對于上述處理B和處理C，分別添加LAFFORT果酒專用果膠酶（酶活力為30000 u/g），用量為0.2 g/ L，并適量添加偏重亞硫酸鉀，添加量為60 mg/L，充分?jǐn)嚢琛處理不添加果膠酶。另設(shè)對照（CK），即破碎后的桑椹，連果皮一起用于釀酒，但不添加果膠酶。

（3）糖酸度調(diào)整：根據(jù)桑椹本身糖度以及桑椹酒酒度（10°）要求，添加一定量的食糖，調(diào)整桑椹汁糖度至250 g/L。按桑椹酒要求，調(diào)整酸度至6 g/L。

（4）發(fā)酵：活化后的酵母，按一定比例用量，加入到桑椹汁中充分?jǐn)嚢?，?0～32℃下發(fā)酵，當(dāng)殘?zhí)切∮?.0 g/L時，結(jié)束主發(fā)酵［4］。

發(fā)酵過程中，每隔24 h抽樣，進(jìn)行白藜蘆醇分析。

1.3.3 發(fā)酵條件的控制

在不同發(fā)酵溫度、不同發(fā)酵時間以及不同酵母條件下，測定白藜蘆醇的含量。

1.3.4 桑椹酒試樣的HPLC測定

3.培養(yǎng)聯(lián)系人的作用未充分發(fā)揮。根據(jù)問卷調(diào)查顯示，相當(dāng)多的入黨積極分子認(rèn)為培養(yǎng)聯(lián)系人的作用發(fā)揮不夠明顯，培養(yǎng)措施不力，與培養(yǎng)聯(lián)系人間的溝通交流不多，極個別入黨積極分子甚至無法準(zhǔn)確說出自己的培養(yǎng)聯(lián)系人。在影響培養(yǎng)聯(lián)系人作用發(fā)揮的因素方面，大多數(shù)認(rèn)為“工作太忙，聯(lián)系較少”，其次為“培養(yǎng)教育方式較為生硬”。通過《入黨積極分子培養(yǎng)考察登記表》也可以佐證：許多培養(yǎng)聯(lián)系人對培養(yǎng)考察意見填寫內(nèi)容不夠詳實、具體，優(yōu)點多，缺點少，或者只寫優(yōu)點，不寫缺點，未能如實反映出入黨積極分子期間的表現(xiàn)，并且不能及時將培養(yǎng)考察意見反饋給被培養(yǎng)人。

表1 桑椹酒釀制原料配備表Table 1 List of raw material for brewing mulberry wine

在與測定白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品相同的條件下，測試各種處理的桑椹酒白藜蘆醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇的HPLC圖譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線

SIGMA產(chǎn)的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC圖譜見圖1。

以白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)樣HPLC圖譜Figure 1 HPLC chromatogram of resveratrol standard sample

圖2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve of resveratrol

2.2 不同處理對桑椹酒白藜蘆醇含量的影響

桑椹汁（處理A）未添加果膠酶發(fā)酵至第4 d的桑椹酒白藜蘆醇的HPLC圖譜，見圖3。

每24 h抽取發(fā)酵液樣品，比較處理A、處理B和處理C的發(fā)酵液中白藜蘆醇含量，同時測定對照CK的白藜蘆醇含量，結(jié)果見圖4。

圖3 桑椹酒白藜蘆醇HPLC圖譜（發(fā)酵第4 d）Figure 3 HPLC chromatogram of resveratrol in mulberry wine（4thday of fermentation）

圖4 不同的處理發(fā)酵至第4 d的白藜蘆醇含量Figure 4 Resveratrol content in fermentation 4thday

圖4顯示，有桑椹果皮的（處理B、處理C和對照CK）發(fā)酵液中白藜蘆醇含量高于不含果皮的（處理A）發(fā)酵液；額外添加果皮（處理C）的白藜蘆醇含量又高于不添加果皮（處理B）；額外添加果皮的3份材料中，期白藜蘆醇含量又以果皮添加多高于添加少的（即C-3＞C-2＞C-1）。而添加果膠酶的桑椹（對照CK）發(fā)酵液中白藜蘆醇含量高于不添加果膠酶的，說明添加果膠酶，對提高發(fā)酵液中白藜蘆醇的含量也有一定的作用。

在圖3中還可以看到，發(fā)酵到第4 d，處理A、B、C-1、C-2、C-3和CK發(fā)酵液中白藜蘆醇含量分別為2.5、3.9、4.3、4.5、4.5和2.7 mg/L。

2.3 發(fā)酵條件對桑椹酒白藜蘆醇含量的影響

發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度，對白藜蘆醇含量也有一定影響。結(jié)果見表2和表3。

表2和表3顯示，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對發(fā)酵液中白藜蘆醇的含量都有一定的關(guān)系。從中可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間從0 h開始到發(fā)酵至第96 h，白藜蘆醇含量逐漸升高，到96 h時為最高，當(dāng)繼續(xù)延長發(fā)酵時間后，白藜蘆醇含量均有不同程度的下降。

以發(fā)酵至第96 h為基準(zhǔn)，考察不同溫度下發(fā)酵液中白藜蘆醇含量時發(fā)現(xiàn)，26～32℃條件下，白藜蘆醇含量均比較理想，但考慮到實際生產(chǎn)因素和桑椹酒成品的品質(zhì)等因素，以28℃比較適宜。

表2 發(fā)酵時間與桑椹酒白藜蘆醇含量的關(guān)系Table 2 The relation between the time and the resveratrol content （單位：mg/L）

表3 發(fā)酵溫度與桑椹酒白藜蘆醇含量的關(guān)系Table 3 The relation between the temperature and the resveratrol content （單位：mg/L）

在28℃、發(fā)酵96 h，酵母用量為200mg/L［5］，不同品種酵母發(fā)酵后，發(fā)酵液中白藜蘆醇含量，見圖5。

圖5 不同酵母發(fā)酵后白藜蘆醇含量的比較Figure 5 Comparison of resveratrol content

就選用的3種酵母而言，發(fā)酵后桑椹酒中的白藜蘆醇含量沒有規(guī)律，在不添加果膠酶的樣品里，用安琪SY發(fā)酵的桑椹酒中白藜蘆醇含量稍高；而添加額外桑椹果皮的，則是用拉氟德F33發(fā)酵的桑椹酒中白藜蘆醇含量稍高。

3 結(jié)果與討論

（1）額外添加桑椹果皮發(fā)酵，可以提高桑椹酒中白藜蘆醇的含量。

桑椹酒發(fā)酵過程中，桑椹果皮中的部分白藜蘆醇會溶解、釋放到發(fā)酵液中；而額外添加桑椹果皮，也就是利用了這部分桑椹果皮中的白藜蘆醇，使這些白藜蘆醇能溶解、釋放到發(fā)酵液中，使發(fā)酵液中的白藜蘆醇含量得到一定程度的提高。

然而，處理C-3與處理C-2之間，白藜蘆醇的含量相差不大，考慮到后道工序處理的問題，C-2可以作為比較合適的選擇。

（2）發(fā)酵條件的不同，桑椹酒中白藜蘆醇的含量也會有所不同。

從發(fā)酵時間來看，發(fā)酵至96 h后，白藜蘆醇含量呈現(xiàn)最高值，如果發(fā)酵至96 h時主發(fā)酵已經(jīng)完成，則可以考慮96 h為比較合適的發(fā)酵時間。同理，在發(fā)酵工藝設(shè)計的時候，也應(yīng)該考慮到96 h的發(fā)酵時間為白藜蘆醇含量最高的時間點，應(yīng)盡量考慮發(fā)酵到96 h左右，完成主發(fā)酵。

發(fā)酵溫度從20℃到32℃之間，隨著發(fā)酵溫度的提高，白藜蘆醇含量也隨之提高，這可能是在較高的發(fā)酵溫度有利于桑椹果皮中白藜蘆醇的釋放。但考慮到溫度過高，會對桑椹酒的香氣和乙醇造成一定的損失，因此結(jié)合感官品質(zhì)等因素，考慮以28℃比較適宜。

（3）利用其他方法，提高白藜蘆醇含量。

前文［5］已報道過，通過紫外線照射桑椹也可以提高桑椹白藜蘆醇含量?？紤]到這些因素，可以綜合各種處理方法，使得桑椹酒中白藜蘆醇含量得以提高。

［1］Jang M.，Cai L.，Udeani G.O.，et al．Cancer chemopreven?tive activity of resveratrol，a natural product derived from grapes［J］.Science，1997，275：218～200.

［2］Hain Ruediger，Reif Hans-Joerg，Krause Elvira，et al．Disease resistance results from foreign phytoalexin ex?pression in a novel plant［J］.Nature，1993，361（6408）：153～156.

［3］Sun NT，Woo SH，Cassady JM，et al.DNA polymerase and topoisomerase II inhibitors from psoralea corylifolia［J］.J Nat Prod，1998，（61）：362～366.

［4］馬佩選.葡萄酒質(zhì)量與檢驗［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2002.

［5］朱祥瑞，章本學(xué)，楊逸文，等.桑椹及桑椹酒白藜蘆醇的含量變化［J］.蠶桑通報，2013，（44）3：32～35.

Brewing Method of Increase Resveratrol Content in Mulberry Wine

ZHU Xiang-rui1,YANG Yi-wen2,ZHAN Peng-fei3,ZHANG Ben-xue2,SHEN Jian-dong4
（1.Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;
2.Anji Chaolong Sericultural Development Company,Anji 313300 Zhejiang,China;
3.Huzhou Academy of Agricultural Science,Huzhou 3130600 Zhejiang,China;
4.Shanghao Sericultural Professional Cooperatio,Nanxun 313000 Zhejiang,China;）

In order to explore effect of adding mulberry bark,3 saccharomyces cerevisiae,fermentation temperature,fer?mentation time on contents of resveratrol in mulberry wine,variety Da 10 of mulberry from Anji of Huzhou city were used as raw material to make wine,the resveratrol in the wine was detected by HPLC.The result showed that ferment?ing to 4th day,the resveratrol contents of treatment A、B、C-1、C-2、C-3 and CK in wines respectively were 2.5、3.9、4.3、4.5、4.5 and 2.7 mg/L;fermentation time from 0 to 96 hours,the resveratrol contents was raised gradually,it was to high?est in 96 th hours;fermentation temperature from 26～32℃,the resveratrol contents all are fine,but the 28℃was bet?ter;The effect of saccharomyces cerevisiae on resveratrol contents in mulberry wine was irregular.

resveratrol;content;mulberry wine

S886.9

A

0258-4069［2014］01-026-04

湖州市科技局攻關(guān)計劃農(nóng)業(yè)項目（2012C22154）

朱祥瑞（1957-），博士，副教授。主要從事蠶業(yè)資源開發(fā)利用的教學(xué)科研和推廣。E-mail：xrzhu@zju.edu.cn