葉郁紅 張 聲＊ 葉建剛 王行富 陳余朋 王鵬程

（1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福州350005；2福建省福州肺科醫(yī)院 福州350008）

PAX－5（paired－box domain 5）又稱B細(xì)胞特異性激活蛋白（B cell specific activator protein，BSAP），是1989年由Barberis等［1］確認(rèn)的一種B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，對B細(xì)胞的發(fā)育、增殖和分化起著關(guān)鍵作用。CD117和血小板衍生生長因子受體 α（platelet－derived growth factor receptor alpha，PDGFRA））屬于酪氨酸激酶受體，是胃腸道間質(zhì)瘤相對特異性的標(biāo)記和分子治療的靶點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PAX－5、CD117、PDGFRA 在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中表達(dá)，但多是局限于肺內(nèi)的研究，關(guān)于這三者在胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（gastrointestinal neuroendocrine neoplasm，GINEN）中的表達(dá)研究很少，國內(nèi)未見報道。本研究擬通過分析PAX－5、CD117、PDGFRA、P53、Ki－67在 GINEN 中的表達(dá)情況，旨在發(fā)現(xiàn)與GINEN的腫瘤分級、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后轉(zhuǎn)歸相關(guān)的指標(biāo)，為進(jìn)一步開展GINEN的分子靶向治療提供病理學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1.研究對象

復(fù)習(xí)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科1995年至2012年間材料可靠的GINEN切片，按照2010年WHO新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，得到GINEN96例，其中胃65例，小腸9例，結(jié)腸7例，闌尾4例，直腸11例；男性78例，女性18例；年齡14－80歲，平均年齡62歲。神經(jīng)內(nèi)分泌瘤1級（neuroendocrine tumor，NET1級）26例，神經(jīng)內(nèi)分泌瘤2級（neuroendocrine tumor，NET2級）4例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）66例（小細(xì)胞癌31例，大細(xì)胞癌13例，混合型神經(jīng)內(nèi)分泌癌22例）［2］。2010年WHO胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤TNM臨床分期，I期15例，II期15例，III期56例，IV期10例。術(shù)前未經(jīng)放化療且隨訪資料完整的有73例，其中死亡33例，生存時間平均17.4月；存活40例，存活者自診斷日期到隨訪日期最短2個月，最長111個月，平均35.9個月。

2.方法

制備好組織芯片，采用Dako Envision二步法免疫組化染色；一抗 PAX－5、P53、Ki－67購自 Thermo公司，CD117、PDGFRA購自Dako公司。染色按產(chǎn)品說明書程序進(jìn)行操作，每批實驗均同時設(shè)立陰性對照和空白對照。

3.結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

CD117表現(xiàn)為細(xì)胞膜染色，可伴有胞漿著色；PDGFRA為細(xì)胞漿染色。根據(jù)著色強(qiáng)度和著色細(xì)胞百分率判斷結(jié)果；染色強(qiáng)度：無著色0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；著色細(xì)胞所占比例：無著色0分，＜30%為1分，30%－70%為2分，＞70%為3分；兩項相乘，1－3分為陰性，4－9分為陽性。PAX－5：細(xì)胞核表達(dá)黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≥30%定為陽性。P53：細(xì)胞核表達(dá)黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≥20%定為陽性。Ki－67：細(xì)胞核表達(dá)黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)＞20%定為陽性，21%－50%定為低表達(dá)，＞50%定為高表達(dá)。

4.統(tǒng)計方法

由于NET1級和NET2級的病例數(shù)較少，本研究將這兩組合并為NET與NEC進(jìn)行比較。NET與NEC的免疫組化陽性率的比較，不同腫瘤大小陽性率的比較，各期陽性率的比較，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組陽性率的比較均采用非參數(shù)檢驗；神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤隨訪資料進(jìn)行單因素生存分析（Logrank檢驗）和多因素生存分析（Cox比例風(fēng)險模型）。

以上分析均采用SPSS19.0軟件包計算，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.PAX－5、CD117、PDGFRA、P53 在 GINEN的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

96例GINEN中，30例PAX－5陽性表達(dá)，占31.3%（圖1）；19例CD117陽性表達(dá)，占19.8%（圖2）；51例PDGFRA 陽性表達(dá)，占53.1%（圖3）；41例P53陽性表達(dá)，占42.7%。PAX－5、CD117、PDGFRA、P53表達(dá)均與多種臨床病理因素有相關(guān)性（表1）。

2.生存分析

GINEN患者平均生存期55.9月，中位生存期40.0月，1、2、3年生存率分別為74.6%、59.6%、52.0%。經(jīng)Log－rank檢驗，組織學(xué)類型、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CD117、P53、Ki67表達(dá)與GINEN生存期顯著相關(guān)（表2）；胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌（gastrointestinal neuroendocrine carcinoma，GINEC）的預(yù)后與CD117表達(dá)、Ki67高表達(dá)及臨床分期顯著相關(guān)（χ2＝8.685，10.124，3.912；P ＝0.003，0.001，0.048）。

將生存時間（月）、生存狀態(tài)（生存或死亡）、患者性別（男＝1，女＝2）、年齡（14－59＝1，60－80＝2）、腫瘤類型、大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無轉(zhuǎn)移＝1，有轉(zhuǎn)移＝2）、化療（無＝1，有＝2）、CD117、P53、Ki－67免疫組化結(jié)果納入Cox回歸模型。結(jié)果顯示：TNM分期、CD117表達(dá)與GINEN患者生存時間有關(guān)（表3）。其次，對GINEC進(jìn)行Cox分析，腫瘤類型（小細(xì)胞癌及非小細(xì)胞癌），Ki67（高及低表達(dá)）及相關(guān)指標(biāo)納入Cox回歸模型。結(jié)果顯示：Ki67高表達(dá)與生存時間有關(guān)（表4）。

表1 PAX－5、CD117、PDGFRA、P53表達(dá)與GINEN患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between the expression of PAX－5、CD117、PDGFRA、P53 and the clinicopathological data in GINEN

圖1 PAX－5在胃小細(xì)胞癌中的表達(dá)（Envision×400）圖2 CD117在胃小細(xì)胞癌中的表達(dá)（Envision×400）圖3 PDGFRA在胃混合型NEC中的表達(dá)（Envision×400）Fig.1 Immunohistochemical expression of PAX－5 in gastric small cell neuroendocrine carcinoma（Envision×400）Fig.2 Immunohistochemical expression of CD117 in gastric small cell neuroendocrine carcinoma（Envision×400）Fig.3 Immunohistochemical expression of PDGFRA in gastric mixed neuroendocrine carcinoma（Envision×400）

表2 73例GINEN患者單因素分析結(jié)果Table 2 Results of the univariate analysis for 73 GINEN patients

表3 GINEN Cox模型多因素分析結(jié)果Table 3 Cox variables in the equation of GINEN

表4 GINEC Cox模型多因素分析結(jié)果Table 4 Cox variables in the equation of GINEC

討 論

GINEN是一組異質(zhì)性腫瘤，主要包括NET（1級和2級）與NEC（3級），這兩者在發(fā)病機(jī)制、臨床病理特征、治療及預(yù)后方面都有顯著不同［3］。本研究的結(jié)果顯示，NET 與 NEC在 PAX－5、CD117、PDGFRA、P53的表達(dá)上有差異。PAX－5屬于個體發(fā)育調(diào)控基因，它的異常表達(dá)促使細(xì)胞增殖、分化、凋亡出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。正常情況下PAX－5局限表達(dá)在淋巴及造血器官，也可作為癌基因表達(dá)于B細(xì)胞淋巴瘤和一些實體腫瘤，如Merkel細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌［4］。Kanteti等［5］通過對細(xì)胞系和腫瘤組織的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)PAX－5在小細(xì)胞肺癌及大細(xì)胞肺癌中均有較高表達(dá)率（分別為66%和55%），類癌表達(dá)率僅為27%，而在非小細(xì)胞肺癌、間皮瘤、食管癌等其他腫瘤中均無明顯表達(dá)。Song等［6］觀察了89例肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌的石蠟標(biāo)本，進(jìn)一步證實PAX－5在類癌的表達(dá)（陽性率為29%）顯著低于非典型類癌（陽性率為67%）、小細(xì)胞癌（陽性率為82%）及大細(xì)胞癌（陽性率為73%）?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)多是PAX－5在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的研究，而在GINEN的研究則未見報道。本研究中43.9%胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌表達(dá)PAX－5，略低于肺內(nèi)的表達(dá)水平；但是PAX－5顯著表達(dá)于高級別神經(jīng)內(nèi)分泌癌的規(guī)律與肺的研究結(jié)果相符合。CD117和PDGFRA是細(xì)胞生長和分化調(diào)節(jié)中的重要分子，是惡性腫瘤潛在的作用靶點。同PAX－5的研究相似，這兩者也都在Merkel細(xì)胞癌及肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中表達(dá)［7，8］。最近的一項對119例胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的表達(dá)研究顯示，CD117和PDGFRA的表達(dá)率分別為13%和33%，且二者的表達(dá)率隨著腫瘤級別的增高而上升；與之相比較，本研究CD117和PDGFRA的表達(dá)率略高（分別為19.8%和53.1%），CD117和PDGFRA在NEC表達(dá)率高，但只有PDGFRA的表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。P53突變是胃癌最常見的遺傳學(xué)改變，Erler等指出［8］70%胃NEC有P53過表達(dá)，但胃NET只有14%。本研究中59.1%胃腸NEC表達(dá)P53，6.7%胃腸NET表達(dá)P53，與文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)大致相符。因此，PAX－5、PDGFRA、P53的顯著表達(dá)差異進(jìn)一步證實NET與NEC之間有著不同的發(fā)病機(jī)制；對于形態(tài)上介于高、低級別之間的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，這3者的表達(dá)可能成為分級的輔助手段。其次，本研究PAX5、CD117、PDGFRA及P53的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有顯著相關(guān)性，提示可能與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，有待進(jìn)一步的研究來證實。

內(nèi)分泌腫瘤病人常處于晚期，缺少有效的治療方式，分子靶向治療成為近年來的研究熱點［10］。研究表明PAX－5能夠上調(diào)c－Met轉(zhuǎn)錄因子在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、分化、運動及侵襲；而敲除或降低PAX－5基因表達(dá)與應(yīng)用c－Met抑制劑有協(xié)同殺死小細(xì)胞肺癌的作用［5，6］。本研究的數(shù)據(jù)顯示，PAX－5在部分GINEN表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，提示PAX－5可以作為GINEN治療的潛在靶點，需要進(jìn)一步分子生物學(xué)的研究來加以證實。另外，雖然CD117和PDGFRA在GINEN有表達(dá)，但文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)突變；Gilbert等復(fù)習(xí)了104例神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，指出其缺乏CD117和PDGFR的分子突變［12］；Knosel等［9］也只發(fā)現(xiàn)1例胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤有c－Kit突變。有的文獻(xiàn)甚至認(rèn)為格列衛(wèi)對惡性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤似乎并無多大治療效果，反而有明顯的毒性［11］。因此格列衛(wèi)能否應(yīng)用于GINEN的治療有待于收集更多的臨床數(shù)據(jù)來加以分析。

GINEN是一組惡性腫瘤，預(yù)后因素包括性別、年齡、種族、診斷時年齡、腫瘤分期以及組織學(xué)分級等［13］。本研究的結(jié)果顯示，CD117、P53、Ki－67的表達(dá)與GINEN預(yù)后差相關(guān)，這與Erler等［8］對肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的研究結(jié)果一致。最近的對胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的研究［9］認(rèn)為CD117及PDGFRA的表達(dá)與預(yù)后差顯著相關(guān)，且PDGFRA可以作為獨立的預(yù)后因子，而本研究中CD117及臨床分期作為GINEN的獨立預(yù)后因子。對于本組病例的主要成員GINEC，Ki67高指數(shù)可以作為其獨立的預(yù)后因子，Boo等的研究也發(fā)現(xiàn)高增殖指數(shù)（Ki－67＞60%）可作為胃侵襲性NEC的預(yù)后指標(biāo)［14］。

綜上所述，PAX－5、CD117、PDGFRA、P53可能參與了GINEN發(fā)生、發(fā)展過程，但其確切的機(jī)制尚不清楚；其次CD117表達(dá)是GINEN的獨立預(yù)后因子，Ki67高指數(shù)是GINEC的獨立預(yù)后因子；最后，PAX－5可以作為GINEN治療的潛在靶點，值得進(jìn)一步研究。

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