曹延萍 潘鳳軍 曹志剛 韓志華 李亞林 劉 杰 段惠軍

（1河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，石家莊050017；2邯鄲市第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北邯鄲056002）

腎小球足細胞是終末分化的上皮細胞，幾乎沒有再生能力，作為腎小球濾過屏障的重要組成部分，在維持腎小球通透性，對抗毛細血管腔內(nèi)流體靜水壓方面發(fā)揮重要作用，足細胞的丟失是蛋白尿形成的啟動機制之一，過多丟失足細胞還會導(dǎo)致腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）外露，失去了足細胞支撐的GBM會在毛細血管靜水壓的作用下，受壓突向腎小囊，進而與腎小球壁層上皮細胞黏連，形成腎小球硬化。文獻報道凋亡作為導(dǎo)致足細胞丟失的重要因素之一，在糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用［1，2］。但其凋亡的機制尚有待深入探討。近年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個對多種應(yīng)激敏感并能傳遞凋亡信號途徑的細胞器，并已證明在糖尿病臟器損害過程中普遍存在。我們的前期研究也證實在糖尿病腎損害過程中，ERS被誘導(dǎo)，并可能通過激活GADD153／CHOP及其特有的 Caspase－12凋亡途徑引起腎臟細胞過多丟失，在糖尿病腎病的發(fā)病機制中起重要作用［3－4］。為了證實ERS是否通過介導(dǎo)足細胞凋亡參與DN的發(fā)生，本研究模擬糖尿病的體外環(huán)境，同時以甘露醇作為滲透壓對照組，觀察體外培養(yǎng)的小鼠足細胞的凋亡情況，并通過檢測ERS標志蛋白GRP78及其特有凋亡途徑Caspase－12的表達變化，分析兩者之間的相關(guān)性，探討ERS在糖尿病腎損害足細胞凋亡中的作用及可能機制。

材料和方法

1.材料

H－2Kb－ts A58轉(zhuǎn)基因小鼠條件永生型小鼠足細胞（購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心）。兔抗GRP78單克隆抗體（Neo Markers公司），CASPASE－12單克隆抗體（abcam生物制品有限公司），TUNEL試劑盒（Promega公司）。

2.方法

2.1 足細胞的培養(yǎng)與分組

H－2Kb－ts A58轉(zhuǎn)基因小鼠條件永生型小鼠足細胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心，依據(jù)Mundel P等［5］所述方法復(fù)蘇，培養(yǎng)足細胞，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，待細胞生長速度減慢，體積明顯增大，向四周伸出足突誘導(dǎo)成熟分化后可用于實驗。待細胞融合達60%－80%，無血清培養(yǎng)基同步24 h后，將實驗細胞分成3組：正常糖對照組（NG，D－葡萄糖1 g／l）；甘露醇對照組（M，1 g／l D－glucose plus 24.4 mmol／L mannitol）、高糖培養(yǎng)組（HG，D－葡萄糖4.5 g／l），經(jīng)細胞分組干預(yù)刺激12、24、48、72 h后收集細胞及上清液。

2.2 TUNEL法檢測細胞凋亡

采用6孔板，按實驗分組刺激12、24、48、72 h收集細胞，4%多聚甲醛固定30 min，常規(guī)脫蠟至水，蛋白酶K室溫下消化，TDT酶反應(yīng)液37℃孵育1 h，0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶，Streptavidin－HRP室溫5 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對照采用無酶標記液（刪除TDT）代替TDT酶反應(yīng)液。凋亡細胞核呈棕褐色顆粒，隨機選取6個視野，每個視野細胞計數(shù)不少于200個細胞，計算陽性細胞的百分率。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

⑴按實驗分組刺激12、24、48、72 h收集細胞，70%乙醇固定。⑵離心（1000 r／min，5 min），洗滌，加入DNA染液（PI 50μg／ml，RNA酶10μg／ml及1%的Triton－X100）1 ml，4℃染色30 min，上機檢測。⑶應(yīng)用Expo32ADC軟件分析，二倍體細胞峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰判定為凋亡細胞峰，根據(jù)亞二倍體峰的分布組方圖計算細胞凋亡率。

2.4 免疫細胞化學(xué)檢測

采用6孔板，按實驗分組刺激12、24、48、72 h收集細胞，4%多聚甲醛固定30 min，常規(guī)脫蠟至水，一抗GRP78（1∶100），Caspase－12（1∶1000）稀釋，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，PBS替代一抗作為陰性對照，DAB顯微鏡控制下顯色。免疫細胞化學(xué)結(jié)果應(yīng)用IPP圖文分析軟件分析，每張切片取10個高倍視野，綜合陽性面積和染色深度計算陽性區(qū)域的積分光密度值（IOD），以各組的均值進行比較。

2.5 Western blot檢測

按實驗分組刺激12、24、48、72 h收集細胞，冰冷PBS洗2遍，加入冰冷的裂解液（20 mmol／l Tris－HCl，2.5 mmol／l EDTA，10% 甘 油，0.1%SDS，1%Triton X－100，1%去氧膽酸鈉，10 mmol／l焦磷酸鈉，50 mmol／L 氟化鈉，1 mmol／l礬酸鈉，1 mmol／l PMSF）300μl，冰浴1 h，4℃、12000 r／min－1離心25 min，取上清液。采用考馬司亮藍法測定上清液蛋白濃度，取細胞裂解蛋白50μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺（SDS2PAGE）凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加 入 兔 抗 GRP78、Caspase－12 和 β－actin（1∶1000）多克隆抗體，4℃過夜。洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（1∶5 000稀釋），37℃孵育2 h，TTBS洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶5000稀釋），37℃孵育1.5 h；TTBS洗膜，滴加ECL（增強化學(xué)發(fā)光）試劑，將PVDF膜放入X光片暗盒，在暗室中壓片，顯影，定影。用美國UVP公司Lab Works 4.5軟件對Western blot條帶進行定量分析，讀取積分光密度值（IOD）。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1.高糖誘導(dǎo)了條件永生型小鼠足細胞凋亡

TUNEL分析結(jié)果顯示，正常糖對照組及甘露醇對照組均有少許足細胞凋亡，隨時間延長細胞凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異，于72 h時二組足細胞凋亡率分別為5.8±2.1%及6.7±1.2%，高糖刺激組于12 h及24 h亦有少許足細胞凋亡，但與正常糖對照組及甘露醇組細胞凋亡率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，自48 h起，高糖組足細胞凋亡率較對照組明顯升高（16.3±2.1%），并呈時間依賴性，72 h時足細胞凋亡率達36.3±2.6%，流式細胞術(shù)結(jié)果與TUNEL趨勢大致相同；正常糖對照組與甘露醇對照組間足細胞凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異（圖1）。

圖1 高糖對足細胞凋亡的影響。將分化成熟的足細胞分成3組：正常糖對照組（NG）：D－葡萄糖1 g／L；滲透壓對照組（MG）：D－葡萄糖1 g／L＋24.4 mmol／l甘露醇；高糖刺激組（HG）：D－葡萄糖4.5 g／L；自48 h起，高糖刺激組足細胞凋亡率較對照組明顯升高。A：TUNEL檢測足細胞凋亡。B：隨機選取6個細胞數(shù)超過200個細胞的視野，計TUNEL陽性的足細胞凋亡率。C：流式細胞術(shù)檢測足細胞凋亡。D：流式細胞術(shù)計算足細胞凋亡率。Fig.1 Effects of HG on podocyte apoptosis.Podocytes were incubated with 1 g／l D－glucose（NG group），1 g／l D－glucose plus 24.4 mmol／l mannitol（M group，anosmotic control）and 4.5 g／l D－glucose（HG group）for 12，24，48 and 72 h.Compare with that in control group，the podocyte apoptosis rate in HG increased from 48 h.A：Apoptosis in podocytes was detected using the TUNEL method.Arrows indicate TUBEL－positive（apoptotic）cells.B：TUNEL－positive（apoptotic）cells were counted out of a total of more than 200 cells over six random fields.The results were expressed as apoptosis cell（%）.C：Apoptosis were detected using flow cytometry.D：The results of flow cytometry were expressed as apoptosis rate（%）.Values are expressed as the mean±SD.＊＊P＜0.01，HG versus NG；＃＃P＜0.01，HG versus M.

2.高糖刺激上調(diào)了ERS標志蛋白GRP78在條件永生型小鼠足細胞中的表達

GRP78是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白之一，免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，GRP78在足細胞胞漿表達，呈棕黃色顆粒狀。正常糖對照組及甘露醇對照組陽性表達較弱，高糖刺激組GRP78陽性細胞數(shù)明顯增多。Western blot分析結(jié)果顯示與正常糖對照組及甘露醇組相比，高糖刺激組GRP78于12 h表達升高，24 h表達達高峰（P＜0.05），之后呈下降趨勢，72 h時表達基本降至正常水平，與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異；正常糖對照組與甘露醇對照組間GRP78的表達無統(tǒng)計學(xué)差異（圖2）。

圖2 高糖對足細胞中GRP78蛋白表達的影響。A：免疫組化檢測GRP78蛋白在足細胞中的表達（×100）。B：Western blot檢測GRP78蛋白在足細胞中的表達。對Western條帶進行定量分析，以管家基因β－actin作為內(nèi)參照校正，以目的調(diào)帶和管家基因條帶積分光密度值比值作為最終結(jié)果。Fig.2 Effects of HG on GRP78 protein levels in podocytes.Podocytes were incubated with high glucose（HG，4.5 g／l）from 12 to 72 h.A：GRP78 positive expression was detected by immunocytochemical staining（100×）.B：Expression of GRP78 protein was analyzed by Western blot.The level of GRP78 protein was quantified by densitometric analysis and normalized to the level ofβ－actin.Values are expressed as the mean±SD.＊＊P＜0.05 versus control.

3.高糖刺激在條件永生型小鼠足細胞中激活了ERS特有的Caspase－12凋亡途徑

Caspase－12定位于ER外膜，在膜受體或線粒體凋亡途徑中不被活化，是ERS特有的凋亡途徑。免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，Caspase－12在三組足細胞胞漿均有表達，呈棕黃色顆粒狀，在高糖刺激組表達較正常糖對照組及甘露醇組表達明顯增多。Western blot分析結(jié)果顯示，高糖刺激組Caspase－12表達于各時間點均高于正常糖對照組及甘露醇組，并呈時間依賴性（P＜0.05）。正常糖對照組與甘露醇對照組間Caspase－12的表達無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3）。

圖3 高糖對足細胞中Caspase－12蛋白表達的影響。A：免疫組化檢測Caspase－12蛋白在足細胞中的表達（×100）。B：Western blot檢測Caspase－12蛋白在足細胞中的表達。對Western條帶進行定量分析，以管家基因β－actin作為內(nèi)參照校正，以目的調(diào)帶和管家基因條帶積分光密度值比值作為最終結(jié)果。Fig.3 Effects of HG on Gaspase－12 protein levels in podocytes.Podocytes were incubated with high glucose（HG，4.5 g／l）from 12 to 72 h.A：Caspase－12 positive expression was detected by immunocytochemical staining（100×）.B：Expression of Caspase－12 protein was analyzed by Western blot.The level of Caspase－12 protein was quantified by densitometric analysis and normalized to the level ofβ－actin.Values are expressed as the mean±SD.＊＊P＜0.05 versus control.

4.高糖刺激的條件永生型小鼠足細胞凋亡數(shù)與Caspase－12蛋白表達的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Caspase－12蛋白表達與高糖刺激的條件永生型小鼠足細胞凋亡率呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r＝0.915，P＜0.01。

討 論

DN是糖尿病嚴重并發(fā)癥之一，既往研究認為，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度積聚、腎小球硬化、小管擴張與萎縮、間質(zhì)纖維化是DN特征性病理改變，近年來，隨著對腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能改變研究的深入，作為腎小球濾過屏障主要組成部分的足細胞在DN發(fā)生發(fā)展中的作用，逐漸成為研究熱點［1］。足細胞即腎小球臟層上皮細胞，它附著在腎小球基底膜的外側(cè)，與小球基膜及毛細血管內(nèi)皮細胞共同組成小球的濾過屏障，足細胞的足突通過與肌動蛋白、肌球蛋白等結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)腎小球基底膜的肌原張力，與腎小球內(nèi)皮細胞、基底膜共同抵抗毛細血管內(nèi)的流水靜壓，維持毛細血管襻結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，并一定程度上清除腎小囊腔的免疫復(fù)合物及某些大分子物質(zhì)［6］。足細胞又是終末分化的上皮細胞，缺乏再生能力，Toyoda等［7－8］研究證明，足細胞的損傷與DN蛋白尿及腎功能損害密切相關(guān)，Susztak K［9］在小鼠Ⅰ型、Ⅱ型DM模型中發(fā)現(xiàn)足細胞凋亡增多并伴隨蛋白尿的形成，并在體內(nèi)外實驗中證實，高糖引起氧化反應(yīng)簇（reactive oxygen specie，ROS）產(chǎn)生增多，參與了足細胞的凋亡，導(dǎo)致其數(shù)量和密度的下降，腎小球的通透性和基膜完整性受損，蛋白尿的發(fā)生并最終形成腎小球硬化，是DN早期發(fā)病的重要機制。

凋亡的起源問題，既往認為線粒體在其發(fā)生過程中起核心作用，近來研究結(jié)果證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在控制細胞命運中具有更重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是真核細胞中蛋白質(zhì)翻譯合成和細胞內(nèi)鈣離子的儲存場所，對細胞應(yīng)激反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。缺血、缺氧、錯誤折疊蛋白的積聚、Ca2＋穩(wěn)態(tài)失衡等都可干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能，這種亞細胞器病理狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS最初誘導(dǎo)適應(yīng)性的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子伴侶的表達，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊的功能，改變其轉(zhuǎn)錄及翻譯過程，減少蛋白合成，降低進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白量，同時細胞還可以通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解途徑的相關(guān)基因表達，加速未折疊蛋白的降解過程，因此UPR最初的目的是為了促進細胞對內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)能力，以期重建正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。UPR一條主要的途徑就是上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，幫助修復(fù)未折疊蛋白，及時有效的逆轉(zhuǎn)ERS，增強細胞的存活能力。GRP78屬于熱休克蛋白（HSP70）家族，也稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP），是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白之一，生理情況下，GRP78在基礎(chǔ)水平表達，主要功能是作為分子伴侶參與新生多肽鏈的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運，通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件PERK、IRE1以及ATF6的結(jié)合，抑制ERS的激活［10］，GRP78的誘導(dǎo)廣泛被認為是ERS的標志性分子［11］。ERS被誘導(dǎo)后，未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，使GRP78從3種跨膜蛋白上解離下來，從而去結(jié)合未折疊蛋白，解離后的感受蛋白被活化并啟動UPR，減低未折疊或錯誤折疊蛋白在ER內(nèi)的積聚，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。GRP78是觸發(fā)UPR的關(guān)鍵蛋白，顯示出細胞保護的潛在作用，有研究表明細胞過表達GRP78可以有效抵抗ERS［12］。盡管早期ERS通過激活UPR及時有效的逆轉(zhuǎn)ERS增強細胞的存活能力，但ERS持續(xù)存在時，凋亡將是其最終的結(jié)局。ERS可以激活多條途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，盡管ERS介導(dǎo)的凋亡途徑并沒有完全闡明，但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Caspase－12的活化已經(jīng)被確認參與這個過程［13］。Caspase－12定位于ER外膜，是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，在膜受體或線粒體凋亡途徑中不被活化，是ERS特有的凋亡途徑。Rao等報道ERS導(dǎo)致GRP78－procaspase12－procaspase7復(fù)合物形成，過度應(yīng)激最終使這一多聚復(fù)合物裂解，釋放活性Caspase－12，激活其下游的Caspase級聯(lián)凋亡途徑。

研究表明，高糖可以誘導(dǎo)引起ERS的許多因素［14］，據(jù)報道，高糖影響內(nèi)環(huán)境中的 Ca2＋，抑制Ca2＋通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的能力，使得Ca2＋在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲積、釋放以及再次泵入障礙，并且，高糖易引起氧化產(chǎn)生過氧化氫并產(chǎn)生活性中間體，氧化應(yīng)激在DM腎損傷中起重要作用［15，16］。除了高血糖，低氧、脂質(zhì)沉積、分泌性蛋白合成增多等因素均可引起ERS。我們前期的研究結(jié)果顯示，DM大鼠腎損害過程中誘導(dǎo)了 ERS，其相關(guān)凋亡途徑 CHOP／GADD153、Caspase－12可能參與了腎臟固有細胞凋亡并在DM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3，4］。這促使我們采用體外培養(yǎng)條件永生性小鼠足細胞作為研究對象，排除其他干擾，探討ERS在足細胞凋亡中的作用及其相關(guān)機制。

我們的研究結(jié)果顯示，與正常糖對照組相比，高糖刺激組GRP78于12 h表達升高，24 h表達達高峰（P＜0.05），之后呈下降趨勢，72 h時表達基本降至正常水平，與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異；ERS特有凋亡途徑Caspase－12蛋白在高糖組的表達較正常對照組明顯增高，并隨著時間的延長表達呈增高的趨勢。這些結(jié)果提示高糖刺激的足細胞很快誘導(dǎo)了ERS，一方面積極調(diào)動UPR反應(yīng)蛋白，以抵御應(yīng)激誘因造成的不利影響，調(diào)整內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能以適應(yīng)新的內(nèi)環(huán)境變化要求，但這種保護作用是短暫的；與此同時，也表達了Caspase－12，這種ERS特有的可能導(dǎo)致細胞死亡的蛋白。結(jié)果還顯示高糖刺激組在12 h及24 h有少許條件永生型小鼠足細胞發(fā)生凋亡，但較正常糖對照組、甘露醇組足細胞凋亡率并無統(tǒng)計學(xué)差異，隨著刺激時間的延長，于48 h高糖組足細胞凋亡率較兩對照組均明顯升高，并隨時間延長呈增多趨勢，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Caspase－12蛋白表達與高糖刺激的條件永生型小鼠足細胞凋亡率呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r＝0.915，P＜0.01。我們推測起初由于UPR的保護作用，足細胞的凋亡率較對照組并無明顯增多，隨著應(yīng)激反應(yīng)的進一步演進，短暫的UPR不足以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，通過Caspase－12凋亡途徑誘導(dǎo)足細胞的凋亡作用來摧毀這些受損的細胞可能是解決內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激受損細胞不得已的最后措施，以最后清除那些根本無法恢復(fù)到正常功能狀態(tài)的應(yīng)激細胞，這可能在DM腎組織損害病理過程中發(fā)揮重要作用，但仍需我們進一步通過干擾ERS不同環(huán)節(jié)，更加明確ERS在糖尿病腎損傷發(fā)病機制中的作用，從而更深入的了解DM腎損傷的潛在分子機制，為疾病治療方案的全新設(shè)計提供新思路。

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