張長春 陸泉秀 周新社 鮑正齊 胡建國 丁 海 許 剛 周建生＊

（1安徽省蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨科，蚌埠233004；2安徽省組織移植重點實驗室，蚌埠233004）

目前通過手術方式對滑脫椎體進行復位和椎間融合是治療腰椎滑脫的最終方法。但國內外有學者認為［1，2］，對于Ⅰ和Ⅱ度的腰椎滑脫只需要原位脊柱融合即可，對I度滑脫復位反而易引起并發(fā)癥。而手術進行脊柱融合不僅創(chuàng)傷大，治療費用高，而且術中使用的融合材料，包括自體骨、異體骨和人工骨等都存在著各種不足。臨床病例研究發(fā)現(xiàn)某些椎間盤組織鈣化，可以形成高密度的骨組織［3］。而通過微創(chuàng)技術人工誘導椎間盤組織使其鈣化，則有希望達到椎體融合的目的。因此，本研究通過建立家兔椎間盤髓核細胞的體外培養(yǎng)模型，研究重組人生長分化因子－5（recombinant human growth differentiation factor－5，rh GDF－5）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對髓核細胞成骨潛能的激發(fā)作用。

材料和方法

1.試劑與儀器

rh GDF－5（Peprotech公司，美國），bFGF（Peprotech公司，美國），鼠抗人I型膠原抗體、鼠抗人Ⅱ型膠原抗體（Chemicon公司），Envissin＋TM Peroxidase Rabbit（DAKO公司），MTT試劑盒（碧云天生物技術研究所），骨鈣素放射免疫檢測試劑盒（北京東亞免疫技術研究所），磷酸鹽緩沖液（武漢博士德生物技術有限公司）。

2.髓核細胞的提取和培養(yǎng)

取健康成年家兔4只，無菌條件下取出兔胸腰段脊柱，仔細分離出椎間盤髓核組織，剪碎至1 mm3，經(jīng)0.1%Ⅱ型膠原酶消化后離心、重懸兩次，得到髓核細胞后0.4%臺盼蘭染色并用血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，計算細胞活力（細胞活力＝未被染色活細胞數(shù)量÷細胞總數(shù)×100%），得到高成活率、成份均一的椎間盤髓核細胞。用差速貼壁法純化細胞，得到純度更高的髓核細胞。按1×105／ml密度將細胞分別接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含15%胎牛血清的DMEM，青霉素100 U／ml、鏈霉素100 U／l，待細胞貼壁后每3 d進行傳代，收集，倒置顯微鏡觀察生長情況。

3.實驗分組

取上述第三代細胞，按細胞因子不同分為四個培養(yǎng)組：A組（對照組）：DMEM／15%FBS培養(yǎng)基；B組（rh GDF－5）：DMEM／15%FBS培養(yǎng)基＋rh GDF－5（0.1μg／ml）；C組（bFGF）：DMEM／15%FBS培養(yǎng)基＋bFGF（10 ng／ml）；D 組（rh GDF－5＋bFGF）：DMEM／15%FBS培養(yǎng)基＋rhGDF－5（0.1μg／ml）＋bFGF（10 ng／ml）。

4.Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色

取第三代細胞爬片后PBS洗片，4%多聚甲醛固定10 min后3%H2O2、10%正常山羊血清室溫依次孵育10min，傾去血清先后滴加一抗（4℃過夜），二抗，DBA顯色，沖洗后復染、封片。設置陰性對照（不加一抗，其余步驟相同）。

各組細胞培養(yǎng)至第24 d分別行Ⅰ型、II型膠原蛋白免疫組化染色（按試劑盒步驟進行）。前者用鼠抗人I型膠原抗體為一抗，后者用鼠抗人II型膠原抗體為一抗。

5.Ⅰ型膠原免疫印跡（Western blot）

將上述處理后的各組細胞，迅速冰上勻漿、沸煮10 min，超聲后BCA法測定細胞蛋白濃度。按照溴酚藍：β－巰基乙醇＝1∶3的比例充分混合、震蕩、煮沸10 min。將預染maker和各組樣品依次加入相應泳道進行電泳，待目的蛋白分離后、緩慢的由SDS－PAGE膠轉至NC膜上轉膜、3－5%脫脂奶粉室溫封閉30－60 min、一抗孵育（4℃過夜）、TBS漂洗3次×10 min、二抗室溫下避光孵育1－2 h、TBS漂洗3次×10 min，Odyssey顯色儀顯色分析。

6.放射免疫技術測定骨鈣素表達

各組細胞培養(yǎng)至24 d后取上清液，加入分離劑后，混勻室溫放置20 min，4℃3500 r／min離心20 min，吸棄上清液，檢測沉淀物放射劑量。由放射免疫γ計數(shù)器預先編制程序，直接給出標準曲線、相關參數(shù)及樣品濃度，單位以ng／ml表示。按表1依次進行。

表1 BGP放射免疫技術加液程序（μl）Table 1 Feeding program of BGP radio－immunity technology（μl）

7.四環(huán)素標記鈣結節(jié)及茜素紅染色比較鈣鹽沉積程度

各組細胞培養(yǎng)至24 d時，將其分別在含有1 mg／ml四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，更換正常DMEM／15%FBS培養(yǎng)基再培養(yǎng)1 h，然后用PBS洗滌，95%乙醇脫水后熒光顯微鏡觀察；各組細胞培養(yǎng)至24 d時，95%乙醇固定后，0.1%茜素紅染色，雙蒸水沖洗后，倒置顯微鏡觀察比較各組鈣鹽沉積情況。

8.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，對各組總體方差進行齊性檢驗，用單因素方差分析確定各組均數(shù)間是否有差異，以P＜0.05為差異有顯著性，具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色

Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色胞漿呈黃褐色定義為陽性，結果顯示對照組和rhGDF－5組細胞分泌的Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陰性（圖1A和B）；bFGF組和rh GDF－5＋bFGF組細胞分泌的Ⅰ型膠原免疫組化染色呈陽性（圖1C和D）。四組細胞分泌的Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陰性。

2.Ⅰ型膠原免疫印跡（Western blot）

免疫印跡結果顯示：對照組（Vector）和rh GDF－5組細胞分泌的Ⅰ型膠原蛋白的表達水平顯著低于bFGF組和rhGDF－5＋bFGF組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組細胞Ⅰ型膠原蛋白免疫印跡結果。A.對照組（Vector）和rh GDF－5組細胞Ⅰ型膠原蛋白的表達水平顯著低于bFGF組和rhGDF－5＋bFGF組，DM1A（α－tublin）為內參。B.Ⅰ型膠原蛋白／內參DM1A后圖灰度值的統(tǒng)計圖（＊P＜0.05，＊＊P＜0.05和Vector組比較）。Fig.2 Result of CollagenⅠexpressed in each group.A.The expression level of CollagenⅠprotein in Vector and rh GDF－5 group is lower than that in bFGFand rhGDF－5＋bFGFgroup.The levels of CollagenⅠwas standardized against the level of the DM1A （α－tublin）protein.B.Blot of CollagenⅠ／DM1A protein（＊P＜0.05，＊＊P＜0.05 versus Vector group）.

3.骨鈣素表達水平測定結果

bFGF組細胞分泌的骨鈣素檢測結果與對照組相比較無顯著差異。rhGDF－5組和rhGDF－5＋bFGF組細胞分泌的骨鈣素量均明顯高于對照組（表2）。

表2 第24 d各組細胞上清液中骨鈣素測定結果（ng／ml）Table 2 Osteocalcin detection in the supernate after 24 days＇cultivation

4.四環(huán)素標記鈣結節(jié)

對照組和bFGF組均未見明顯熒光標記的鈣結節(jié)；rh GDF－5組和rh GDF－5＋bFGF組可見明顯的熒光鈣結節(jié)，形狀以圓形為主，伴有少數(shù)不規(guī)則形結節(jié)。rhGDF－5＋bFGF組鈣結節(jié)的大小和數(shù)量均明顯高于GDF－5組的鈣結節(jié)（圖3）。

5.茜素紅染色

對照組未見鈣鹽沉積；rh GDF－5組鈣鹽沉積較A組明顯；bFGF組未見明顯的鈣結節(jié)，提示無明顯鈣鹽沉積。實驗組的鈣鹽沉積最為明顯，形成的鈣結節(jié)無論在大小和數(shù)量上均要高于其他三組（圖4）。

討 論

髓核細胞能特異性地合成和分泌大量的Ⅱ型膠原和聚合蛋白，并且堿性磷酸酶活性非常低［4］。由于長期的缺氧環(huán)境，髓核細胞缺乏線粒體并富含糖原［5］。體外培養(yǎng)的髓核細胞有氧呼吸活動增強，在有或沒有誘導因子作用的情況下，其Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陰性，并且細胞內的糖原減少甚至消失、線粒體增多，這些都提示，髓核細胞出現(xiàn)了向成纖維細胞反分化的特征［6］。

Ⅰ型膠原作為鈣鹽沉積的基礎，是成骨細胞合成分泌的特異性膠原蛋白，當椎間盤發(fā)生退變或鈣化時，髓核細胞分泌的Ⅱ型膠原會減少，Ⅰ型膠原明顯增多［7］。而本實驗中，在bFGF的誘導下髓核細胞Ⅰ型膠原免疫組化呈陽性染色，提示髓核細胞在誘導因子bFGF的作用下出現(xiàn)了轉分化，即具有成骨分化的潛能。

GDF－5屬于TGF－β超家族中的新成員，是機體生長發(fā)育過程的重要生長因子。很多研究顯示其在體內、外均有較強的促進髓核細胞成骨性分化、誘導異位成骨作用［8－11］。Zeng等［11］發(fā)現(xiàn) GDF－5誘導脂肪間充質干細胞使其表達 OC、Cbfal、ALP和VEGF等增加。從而證實GDF－5的礦化作用能誘導脂肪間充質干細胞成骨轉化。Rothamel等［12］研究發(fā)現(xiàn)GDF－5的復合材料，能促進比格犬牙槽脊骨質缺損部位的骨組織形成。這些均提示：GDF－5有顯著的礦化作用。

骨鈣素是成骨細胞分化成熟及基質礦化的特異性指標；Ⅰ型膠原是成骨細胞分泌的主要膠原蛋白，是成骨細胞分化的標志；鈣鹽沉積則是細胞礦化作用的主要表 現(xiàn)［13，14］。本實驗 中 B 組 （rh GDF－5）細胞不論是上清液中骨鈣素表達還是茜素紅染色顯示鈣鹽的沉積，均要比A組強，且明顯抑制髓核細胞的增殖，提示rhGDF－5通過抑制體外培養(yǎng)的髓核細胞的增殖，而誘導其成骨作用；但其并不影響Ⅰ型膠原的表達。

bFGF具有促進細胞有絲分裂、促進軟骨和骨組織損傷修復及行成、促進血管形成等多種生物學作用［15］。Riew 等［16］發(fā)現(xiàn)bFGF能促使細胞合成DNA，促進細胞從靜止期進入增殖期，從而能促進大多數(shù)源于中胚葉和神經(jīng)外胚葉的細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)敲除bFGF基因可引起骨密度降低，骨成長遲緩，導致成骨障礙［17］。本實驗中C（bFGF）組細胞的增殖速度較對照組rhGDF－5組明顯加快，Ⅰ型膠原的表達明顯增強，但骨鈣素表達較A組細胞無顯著差異，茜素紅和四環(huán)素熒光也未見明顯的鈣結節(jié)，故可以推測，bFGF的主要作用是促進細胞增殖，在誘導細胞骨化方面并不如rhGDF－5作用明顯。

成骨誘導和骨形成是一個復雜而又連續(xù)的過程，許多細胞因子通過不同方式在不同環(huán)節(jié)上影響不同時期的成骨細胞生長和代謝［18，19］。GDF－5和bFGF通過不同的途徑和不同的機理作用于椎間盤髓核細胞，誘導髓核細胞成骨分化。GDF－5可誘導髓核細胞成骨分化，促進鈣鹽沉積形成鈣結節(jié)，但同時阻礙了細胞的增殖。bFGF能使細胞DNA合成量增加，促進細胞有絲分裂，從而促進細胞的增殖。但其誘導髓核細胞成骨能力明顯不足。所以，當聯(lián)合使用GDF－5和bFGF時，GDF－5誘導細胞成骨后，為bFGF提供了大量的靶細胞，進而促進成骨細胞的增殖分化。bFGF彌補了DGF－5促細胞增殖能力上的不足，而GDF－5彌補了bFGF成骨誘導活性底下的缺點，使兩者在誘導髓核細胞成骨的生物學功能上形成互補，加速了成骨誘導和骨形成的過程。本實驗中rh GDF－5＋bFGF組的骨鈣素表達最高、Ⅰ型膠原免疫組化的強陽性、明顯的鈣鹽沉積都說明了GDF－5和bFGF有協(xié)同誘導髓核細胞成骨的能力。

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圖 版 說 明

圖1 髓核細胞Ⅰ型膠原免疫組化陰性（A，B）和陽性（C，D箭頭所示）染色（×100）（A：A組；B：B組；C：C組；D：D組）。

圖3 四環(huán)素標記的鈣鹽陰性（A，C）和陽性（B，D箭頭所示）沉積（×200）。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。

圖4 茜素紅染色的鈣鹽（A，C）和陽性（B，D箭頭所示）沉積（×200）。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Negative（A，B）and positive（C，D）staining of typeⅠcollagen in the nucleus pulposus cells in each group by immunohistochemistry staining（×100）（A：group A；B：group B；C：group C；D：group D）.

Fig.3 Negative（A and C）and positive（B and D）calcium deposition in each group by tetracycline marker staning（×200）.A：group A；B：group B；C：group C；D：group D.

Fig.4 Negative（A，C）and positive（B，D）calcium deposition in each group by alizarin red staining（×200）.A：group A；B：group B；C：group C；D：group D.