柯橋利 臺令華 于東紅

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科；蚌埠醫(yī)學院病理學教研室 安徽233004）

胃癌的發(fā)生發(fā)展過程是一個多基因、多步驟共同作用的結(jié)果。其中癌基因的激活和抑癌基因的失活起著極其重要的作用。MDM2是一種癌基因，與P53和Rb結(jié)合后使其失去活性，從而調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡［1，2］。已知幽門螺桿菌（Helicobacterpylo－ri，Hp）與慢性胃炎、胃癌等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，1994年被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列為第一類致癌因子［3］。幽門螺桿菌L型（Hp－L）是Hp的細胞壁缺陷型，常在不利于Hp生長的環(huán)境下形成［4］。因大多數(shù)呈球形，故又稱為幽門螺桿菌球形體。已知Hp－L型的生物學性狀和致病性與原菌有相似之處，也有明顯不同，且與胃癌的發(fā)生有一定關(guān)系［5］。目前國內(nèi)外有關(guān)MDM2蛋白在胃癌組織中表達意義的研究比較少，而MDM2蛋白與Hp－L型感染在胃癌中的關(guān)系則罕見報道。因此我們采用免疫組化、革蘭染色和RT－PCR方法檢測胃癌組織中MDM2的表達及Hp－L型感染的情況，旨在探討胃癌組織中MDM2表達的意義及與Hp－L型感染的關(guān)系。

材料和方法

1.材料

1.1 收集蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科2010年6月至2011年6月間經(jīng)手術(shù)切除胃腺癌石蠟包埋組織塊100例，并隨機抽取40例對應(yīng)切緣正常組織作為對照組，術(shù)前未經(jīng)任何抗癌治療。其中，男68例，女32例；年齡31－83歲，中位年齡57歲。所有標本經(jīng)10% 甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，做HE染色、革蘭染色及免疫組織化學染色。由2名病理主治醫(yī)師復查HE染色切片，病理診斷依據(jù)第4版WHO胃癌組織學分類標準。其中，高、中分化42例，低分化58例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例；癌組織未浸潤至漿膜層22例，浸潤至漿膜層78例。按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）公布的TNM分期標準（2002年，第6版）進行分期：Ⅰ－Ⅱ期69例，Ⅲ－Ⅳ期31例。

1.2 收集2013年2月至2013年6月蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胃癌手術(shù)的新鮮標本30例及遠端正常組織（距腫瘤邊緣組織約5 cm處）作為對照組。所有標本術(shù)前未行放、化療及免疫治療，并均在離體30 min內(nèi)切取。

2.方法及判斷標準

2.1 Hp－L型的測定

1）組織切片經(jīng)革蘭染色油鏡（10×100）下觀察并計數(shù)，每例組織隨機抽取10－15個視野，取平均數(shù)Hp－L和Hp平均數(shù)≥20個為陽性，＜20個或未查見Hp和Hp－L型為陰性。Hp－L型呈多種形態(tài)，有圓球體、短桿狀、絲狀等，且大小不等。革蘭染色陰性呈紅色，陽性呈紫紅色，Hp－L型大多數(shù)呈革蘭染色陰性（即紅色），少數(shù)Hp－L型革蘭染色陽性（紫紅色）。而Hp呈海鷗形、螺旋形或是“S”形。Hp－L型可在胃癌癌巢和癌旁組織中聚集成堆，在癌巢壞死處幾乎無Hp－L型，正常組織中也少見。在L型陽性的切片上可見到其附著在癌細胞及胃黏膜上皮表面，也可見其存在癌細胞內(nèi)。2）免疫組化采用Elivision法，試劑為兔抗人Hp－L型抗體（蚌埠醫(yī)學院微生物學教研室制備），工作濃度為1∶100，同時使用PBS代替一抗作陰性對照組。陽性標準：胃癌細胞、正常胃黏膜上皮細胞胞質(zhì)及間質(zhì)巨噬細胞的胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。革蘭染色L型細菌檢出和免疫組化Hp－L型抗原表達同時陽性者定為Hp－L型感染陽性。

2.2 MDM2的檢測

1）MDM2鼠抗人單克隆抗體購于北京中杉金橋公司，為即用型試劑，采用免疫組化SP法，嚴格按照說明書操作，用PBS代替一抗作陰性組對照。具體判斷標準：應(yīng)用半定量積分法，根據(jù)陽性細胞著色強度及范圍進行評價。MDM2蛋白的陽性位于細胞核和細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，以細胞核為主。每張切片隨機抽取5個高倍鏡（×400）視野觀察，計數(shù)200個腫瘤細胞，計算陽性細胞所占腫瘤細胞的百分比，取平均值。陰性：不著色；弱陽性：淡棕黃色或是陽性細胞所占腫瘤細胞百分比＜50%；強陽性陽性細胞＞50%或者細胞呈棕黃色。2）逆轉(zhuǎn)錄RTPCR法測MDM2在胃癌中的表達，總RNA提?。喝?0－100 mg胃腺癌組織勻漿后用Trizol提取液提取總RNA，取部分總RNA用紫外分光光度儀A260／A280，要求全部樣本 OD260／OD280比值在1.8－2.0之間。cDNA制備：操作過程嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，PCR擴增：上游引物5′GCCATTGAACCTTGTGTGATTT－3′，下游引物 5′－GCAGGGCTTATTCCTTTTCTTT－3′；β－actin上游引物5－AGCGAGCATCCCCCAAAGTT－3，下游引物5′－GGGCACGAAGGCTCATCATT－3′；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min后，以94℃45 s變性，MDM2退火溫度59.1℃，β－actin退火溫度55.7℃，各進行45 s，72℃延伸45 s，反應(yīng)35循環(huán)，最后一輪延伸7 min。PCR產(chǎn)物判定：取5μl擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（電壓按100 V，電流60 m A），溴化乙錠顯色，結(jié)果在GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)中拍攝記錄，并使用Tanon GIS－3500圖像分析軟件行灰度掃描作半定量分析，以 MDM2的吸光度值與β－actin吸光度值的比作為MDM2的基因表達半定量值。

3.統(tǒng)計學方法

使用SPASS17統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行χ2檢驗和t檢驗，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)進行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.胃癌中型的檢測，100例胃癌組織中有79例革蘭染色檢出L型，其檢出率陽性率為79.0%；免疫組化Hp－L型抗原表達陽性的有76例，其陽性率為76.0%，與革蘭染色Hp－L型檢出陽性率一致（P＞0.05），兩組同時出現(xiàn)陽性的有70例，陽性率為70%（即革蘭染色L型檢出陽性和免疫組化Hp－L型抗原表達同時陽性，Hp－L型陽性，見圖1，2），明顯高于對照組的32.5%（P＜0.01，見表1）。

表1 不同組織中Hp－L檢測情況Table 1 The result of Hp－L detected in different gastric tissues

2.MDM2在胃癌組織中的表達

MDM2在胃癌組織中表達陽性率為71.0%（71／100），顯著高于癌旁對照組42.5%（17／40）兩者比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2），經(jīng)χ2檢驗，胃癌組織中MDM2的表達與患者的年齡、性別、腫瘤細胞分化程度無關(guān)，而與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)（均P＜0.05，表2，3；見圖3）

表2 不同組織中MDM2蛋白的表達情況Table 2 The expression of MDM2 in different gastric tissues

表3 胃癌組織MDM2蛋白表達與臨床病理因素的關(guān)系Table 3 Relationship between the expression of MDM2 and clinical pathological characteristics in gastric carcinom

3.MDM2擴增產(chǎn)物與內(nèi)參電泳結(jié)果

胃癌組織和對照組胃黏膜總RNA提取后，MDM2基因 PCR 產(chǎn)物為126 bp，humanβ－actin基因產(chǎn)物為285 bp，在胃癌組織和正常胃黏膜中MDM2 mRNA相對表達量分別為2.432±0.214和0.385±0.132，胃癌組織中MDM2表達明顯高于癌旁正常胃黏膜組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，見表4，圖4）

表4 不同新鮮胃組織中MDM2蛋白的表達情況Table 4 The expression of MDM2 in different fresh gastric tissues

4.胃癌中Hp－L型感染與MDM2蛋白表達的關(guān)系

從表5可見，胃癌Hp－L型陽性組的MDM2表達明顯高于其Hp－L型陰性組，應(yīng)用Spearman秩相關(guān)檢驗，兩者之間呈正相關(guān)（r＝0.447，P＜0.05）。

表5 胃癌組織中MDM2表達與Hp－L型感染的相關(guān)性的分析Table 5 The relativity between expression of MDM2 and the Helicobacter pylori L－form infection

討 論

MDM2（murine double mimutes）是一種原癌基因，該基因在進化過程中比較保守。MDM2蛋白存在細胞核中，通過與P53結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄，MDM2蛋白還能與Rb結(jié)合，作用于靶DNA序列，從而促進細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)MDM2蛋白有發(fā)揮作用的四個結(jié)構(gòu)域：1）N端殘基是P53主要結(jié)合區(qū)域［6］；2）靠近N端是幾個著名 MDM2抑制劑結(jié)合的區(qū)域；3）中間還有個可與多種調(diào)節(jié)基因結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)［7］；4）C端與E3泛素連接酶結(jié)合位點。研究發(fā)現(xiàn)，在多種細胞應(yīng)激下，如在藥物、物理輻射、化學因素等多種作用情況下能夠激活P53，細胞內(nèi)的P53水平升高可以激活與其同一條染色體的MDM2基因進行轉(zhuǎn)錄，MDM2表達升高。激活狀態(tài)下的P53基因?qū)毎芷谶M行調(diào)控的同時又被高表達的MDM2所抑制，從而形成自動調(diào)節(jié)的負反饋調(diào)節(jié)環(huán)，調(diào)控著細胞的增殖與凋亡［8］。過表達MDM2可以引起細胞無限增殖，甚至惡變。有研究發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中該基因發(fā)生基因擴增、突變及表達異常，如胃癌、肝癌、食管癌等［9－11］。Sugano等［12］應(yīng)用實時定量RT－PCR聯(lián)合FISH方法檢測結(jié)直腸癌中MDM2基因擴增，發(fā)現(xiàn)MDM2與腫瘤的臨床分期有一定的相關(guān)性。王曉玫等［13］通過免疫組織化學方法檢測了72例結(jié)直腸癌標本MDM2蛋白表達，顯示結(jié)直腸癌組織MDM2陽性表達與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲的結(jié)直腸癌患者MDM2蛋白表達陽性率相對較高。于雁等［14］通過免疫組化方法檢測了93例大腸癌組織MDM2蛋白表達水平，結(jié)果顯示MDM2蛋白高表達者生存期相對較短。Shimada等［15］研究發(fā)現(xiàn)MDM2過表達的食管鱗癌預(yù)后差。劉遠廷等［16］認為胃癌中MDM2蛋白的表達陽性率明顯高于不典型增生等癌前病變組織，MDM2的表達與胃癌的分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)本研究采用免疫組化法檢測了100例胃癌組及40例對照組的MDM2蛋白表達情況，應(yīng)用RTPCR檢測30例新鮮胃癌組及30例對照組的MDM2 m RNA表達，發(fā)現(xiàn)MDM2在胃癌組中表達明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，本實驗還發(fā)現(xiàn)MDM2蛋白表達陽性率在侵犯漿膜組高于未侵犯漿膜組；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），提示MDM2表達陽性的腫瘤可能具有更強的浸潤和轉(zhuǎn)移能力。

幽門螺桿菌已被證實為某些胃病的原因之一，如活動性胃炎、胃潰瘍，同時，幽門螺桿菌也可能是胃癌的發(fā)病因素之一［17］。Hp在不利于其生長的環(huán)境下為保護自身而發(fā)生細胞壁缺陷而形成Hp－L型，即是Hp適應(yīng)外界不良條件的一種自我保護的形式，具有更大的潛伏性和危險性。其在消化性疾病中的作用已受到越來越多的關(guān)注［18］。Figueroa等［19］報胃癌組織中Hp－L型的檢出率高于潰瘍胃組織中的檢出率，提示Hp－L型的長期存在可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。陳豪等［20］研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Hp－L與原菌比較更易促進細胞增殖，引起胃癌。Kodama M［21］運用免疫組織化學方法研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌感染的胃粘膜上皮細胞MDM2蛋白的表達水平高于幽門螺桿菌陰性的胃粘膜上皮細胞，提示幽門螺桿菌感染能夠誘導MDM2蛋白的表達。實驗研究結(jié)果與上述研究有相似之處，顯示胃癌組中Hp－L型陽性組中MDM2的表達陽性率高于Hp－L型陰性組，且兩者呈正相關(guān)（r＝0.447，P＜0.05），提示Hp－L型可能上調(diào)MDM2的表達從而抑制細胞凋亡而促進腫瘤生長，故Hp－L型感染可能與胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，具體機制有待于進一步研究。

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圖 版 說 明

圖1 Hp－L型呈圓球狀，巨形體、和原生小體等（革蘭氏染色×1000，）A：巨形體（粗箭頭）和圓球形（細箭頭）；B：Hp－L型散在分布癌巢中（細箭頭）

圖2 Hp－L型在胃腺癌中的陽性表達（A，Elivision×100；B，Elivision×400）

圖3 MDM2蛋白在胃腺癌中的表達陽性（A，SP法×100；B，SP法×400）

圖4 MDM2m RNA的瓊脂糖電泳圖（1、3、5為胃癌組，2、4、6為對照組）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Hp－L form cylindrical and spherical，the sphere，giant body and native body（Gram stain×1000Big coccoid Hp－L（thick arrow）and coccoid Hp－L（thin arrow）；B：Hp－L was in gastric cancer nest（thin arrow）

Fig.2 negative expression of Helicobacter pylori L－form in gastric adenocarcinoma（A，Elivision×100；B，Elivision×400）

Fig.3 Positive expression of MDM2 in adenocarcinoma cancerous tissue（A，SP×100；B，SP×400）

Fig.4 Agarose electrophoresis of MDM2mRNA （1、3、5for the gastric cancer group，2、4、6 for the controls group）