于卓，謝銳，于肖夏，馬艷紅，李造哲，紀(jì)明妹

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010019)

高丹草是高粱(Sorghum bicolor)與蘇丹草(Sorghum sudanense)的種間雜交后代，具有高粱鮮草產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)和蘇丹草葉量大、品質(zhì)好等優(yōu)良特性，其不足點(diǎn)是鮮草中含有氫氰酸［1-3］。有研究表明，高丹草品種間氫氰酸含量差異較大，含量高的品種(株高約100 cm時(shí)莖葉鮮草氫氰酸含量≥100 mg/kg)家畜采食量大時(shí)會(huì)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，給生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失［4-6］。選育青刈飼喂安全的超低氫氰酸含量(株高約100 cm時(shí)莖葉鮮草氫氰酸含量1～15 mg/kg，青刈后可直接飼喂家畜)高丹草新品種是預(yù)防氫氰酸危害的有效措施。

為培育青刈飼喂家畜安全的超低氫氰酸含量高丹草新品種，近年來(lái)我們利用在內(nèi)蒙古中西部地區(qū)種植多年的氫氰酸含量低的散穗高粱與黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草和棕殼蘇丹草相組配進(jìn)行人工授粉雜交，獲得4個(gè)雜交組合的F1代，通過(guò)ISSR分子標(biāo)記輔助選育，得到4個(gè)超低氰氫酸含量高丹草新品系SLCN-11(散穗高粱×黑殼蘇丹草F5)、SLCN-12(散穗高粱×白殼蘇丹草F5)、SLCN-13(散穗高粱×紅殼蘇丹草F5)、SLCN-14(散穗高粱×棕殼蘇丹草F5)［7-10］。SSR(simple sequence repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)為共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于牧草和作物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及分子標(biāo)記輔助育種［11-14］。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)SSR標(biāo)記技術(shù)在高丹草品種或品系鑒定方面的應(yīng)用尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。本試驗(yàn)以我們育成登記的高丹草品種蒙農(nóng)青飼3號(hào)為對(duì)照［15］，重點(diǎn)對(duì)上述4個(gè)高丹草新品系及其親本進(jìn)行SSR分析，以明確其在DNA水平上的差異程度，并建立高丹草新品系的SSR指紋圖，為下一步高丹草新品種育成及登記利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為4個(gè)高丹草新品系SLCN-11(散穗高粱×黑殼蘇丹草F5)、SLCN-12(散穗高粱×白殼蘇丹草F5)、SLCN-13(散穗高粱×紅殼蘇丹草F5)、SLCN-14(散穗高粱×棕殼蘇丹草F5)及母本散穗高粱和父本黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草、棕殼蘇丹草，對(duì)照品種為蒙農(nóng)青飼3號(hào)高丹草(Sorghum bicolor×Sorghum sudanense cv.Mengnong Qingsi No.3)。各供試材料的種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院飼用作物育種研究室提供，試驗(yàn)于2012年7月至2013年5月在室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 總DNA提取與純度檢測(cè)

將各供試材料的種子播種在花盆中，室溫條件下培養(yǎng)成苗，在三葉期每種材料隨機(jī)剪取20個(gè)單株幼苗的葉片混合，用植物基因組試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，取5 μL DNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，將各材料的DNA濃度稀釋至50 ng/μL置冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)

擴(kuò)增反應(yīng)體系:反應(yīng)液總體積為 20 μL，其中 ddH2O 11.6 μL，10 × Buffer 2.0 μL，Mg2+1.6 μL，dNTP 1.6 μL，Taq 酶 0.2 μL，上游引物 1.0 μL，下游引物 1.0 μL，60 ng/μL 的模板 DNA 1.0 μL。

擴(kuò)增反應(yīng)程序:在Eppendorf Mastercycler 5331-PCR儀上，95℃變性4 min，1個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，1個(gè)循環(huán)后終止反應(yīng)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測(cè):擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，每樣品點(diǎn)樣8 μL，電泳時(shí)間2 h。膠板在0.15%AgNO3溶液中銀染15 min，取出后蒸餾水速漂5 s，放入含有3%NaOH和0.5%甲醛的溶液中顯色10 min，視條帶清晰后轉(zhuǎn)入固定液終止反應(yīng)，蒸餾水清洗2 min后晾干、掃描。

1.4 SSR適宜引物的篩選

利用已開(kāi)發(fā)的同屬植物高粱的200對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選(http://algodon.tamu.edu/sorghumdb.html提供的引物序列，由上海生物工程公司合成)，選出多態(tài)性豐富的適宜引物，用于PCR擴(kuò)增。試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5 SSR分子標(biāo)記的數(shù)據(jù)處理

將染色好的膠板放在透射光燈箱上，記錄膠板上清晰的條帶，電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶，將所觀察到的每一條帶視為1個(gè)單位，有帶記為1，無(wú)帶記為0，生成0，1組成的數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算下列相關(guān)遺傳系數(shù)［16］。

多態(tài)性位點(diǎn)百分率:對(duì)于某一位點(diǎn)而言，當(dāng)變異個(gè)體頻率大于0.01時(shí)，該位點(diǎn)即為多態(tài)性位點(diǎn)(P):P=(K/N)×100%，式中，K為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目、N為擴(kuò)增位點(diǎn)總數(shù)。

供試材料的遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD):GS=2Sij/(Si+Sj)，式中，Sij為材料i和材料j共有的條帶數(shù)目，Si+Sj為2種材料中出現(xiàn)的條帶數(shù)目之和;GD=1－GS。根據(jù)類(lèi)平均法，運(yùn)用DPS V 8.01分析軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)

用植物基因組試劑盒提取10個(gè)供試材料基因組DNA的電泳條帶清晰、可辨、均勻且無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明所提取的DNA純度高，完全能滿(mǎn)足SSR分析的要求(圖1)。

圖1 供試植物基因組DNA電泳檢測(cè)Fig.1 The electrophoresis of genomic DNA of tested plants

2.2 SSR 擴(kuò)增結(jié)果

以4個(gè)高丹草新品系 SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13、SLCN-14和其親本散穗高粱、黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草、棕殼蘇丹草及蒙農(nóng)青飼3號(hào)高丹草基因組DNA為模板，從200個(gè)SSR引物中篩選出條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的適宜引物12對(duì)(表1)，用于10個(gè)供試材料基因組DNA的PCR擴(kuò)增，共得到576個(gè)SSR位點(diǎn)，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多在200～2500 bp之間，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出48個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)509個(gè)，多態(tài)性百分率達(dá)87.3%。在12對(duì)引物中，以引物Xtxp 7擴(kuò)增的總位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最少，分別為26和18個(gè)，引物Xtxp 96擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)百分率最高，為100%(表2)。

表1 SSR分析所用引物及其堿基序列Table 1 Primers and their nucleotide sequences used for SSR analysis

此外，每對(duì)引物擴(kuò)增的SSR指紋圖均可以清晰地將10個(gè)供試材料區(qū)別開(kāi)來(lái)，這可為高丹草新品系鑒定及下一步新品種育成登記和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)利用提供DNA分子依據(jù)(圖2～4)。

表2 供試植物SSR引物及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 SSR amplification results of tested plants

2.3 遺傳距離和聚類(lèi)分析

10個(gè)供試材料間的遺傳距離(GD)變幅在0.3165 ～0.6692 之間，平均為0.5359(表3);以 GD 值0.50為基準(zhǔn)，10個(gè)材料大體分為5類(lèi):蒙農(nóng)青飼3號(hào)、散穗高粱、SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13 為一類(lèi);SLCN-14、棕殼蘇丹草為一類(lèi);白殼蘇丹草、黑殼蘇丹草、紅殼蘇丹草各單獨(dú)為一類(lèi)(圖5)。

3 討論

植物遠(yuǎn)緣雜交是實(shí)現(xiàn)不同物種間基因交流和創(chuàng)造新種質(zhì)(新物種、新品種)的重要途徑［17-18］。本試驗(yàn)用育成登記的高丹草品種蒙農(nóng)青飼3號(hào)作對(duì)照，將散穗高粱與黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草、紅殼蘇丹草和棕殼蘇丹草種間遠(yuǎn)緣雜交獲得的4個(gè)低氰含量高丹草新品系SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13、SLCN-14［9-10］和其親本間的遺傳差異及親緣關(guān)系進(jìn)行SSR分析顯示，各供試材料間的遺傳距離(GD值)平均為0.5359，遺傳差異較大;10個(gè)材料聚為3類(lèi)，其中在第1類(lèi)的5個(gè)材料中，包含了3個(gè)母本遺傳背景均為散穗高粱的新品系SLCN-11、SLCN-12和SLCN-13，新品系SLCN-14與其沒(méi)有雜交關(guān)系的棕殼蘇丹草聚在一起，另外3個(gè)父本材料黑殼蘇丹草、白殼蘇丹草和紅殼蘇丹草各單獨(dú)為一類(lèi)，即部分遺傳背景相同或不同的雜交新品系并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的聚類(lèi)規(guī)則。這說(shuō)明高粱和蘇丹草種間雜交育成的新品系實(shí)現(xiàn)了親本間基因的復(fù)雜交流，打亂了其親本原有的基因次序，組合形成了新的基因型，這可能是高丹草雜交新品系雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)的重要分子依據(jù)。

圖2 引物xtxp61的SSR指紋圖Fig.2 SSR fingerprint amplified by the primers xtxp61

圖3 引物xtxp69的SSR指紋圖Fig.3 SSR fingerprint amplified by the primers xtxp69

圖4 引物ZCT339的SSR指紋圖Fig.4 SSR fingerprint amplified by the primers ZCT339

表3 供試植物的遺傳距離矩陣Table 3 The genetic distance matrix of tested plants

由于高丹草目前還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出SSR引物，若單獨(dú)開(kāi)發(fā)成本高，故本試驗(yàn)從網(wǎng)上公布 (http://algodon.tamu.edu/sorghumdb.html)的200個(gè)普通高粱(近源同屬植物)的SSR引物中，篩選出多態(tài)性豐富、條帶穩(wěn)定的12對(duì)引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和位點(diǎn)分析，由于這些引物在普通高粱上擴(kuò)增的SSR位點(diǎn)數(shù)目等表現(xiàn)情況目前還未見(jiàn)有研究報(bào)道，尚難與本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，但本試驗(yàn)所用的母本材料散穗高粱是高粱屬的一種，從12對(duì)引物擴(kuò)增的電泳圖片可知，由于引物不同其位點(diǎn)數(shù)不同，總體看散穗高粱的SSR位點(diǎn)數(shù)較多，它們與其余9個(gè)供試材料的SSR位點(diǎn)數(shù)和條帶位置存在著一定的差異，而且每對(duì)引物擴(kuò)增的SSR指紋圖均可將10個(gè)供試材料區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明同屬近緣種普通高粱的SSR引物用于高丹草新品系在DNA水平上鑒定是可行的。

本試驗(yàn)采用植物基因組試劑盒提取各供試植物基因組DNA的質(zhì)量很高，但在試驗(yàn)中應(yīng)注意樣品經(jīng)液氮處理后要迅速研磨成粉末狀，且要避免長(zhǎng)時(shí)間放置研好的樣品，否則會(huì)影響DNA的提取效果，甚至導(dǎo)致DNA提取失敗。另外，在聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)制備過(guò)程中，加速劑TEMED應(yīng)最后加入，并迅速充分混勻、立即勻速灌膠，否則會(huì)導(dǎo)致同一膠板電泳速度不一致，出現(xiàn)非水平的條帶而影響試驗(yàn)結(jié)果。

圖5 10個(gè)供試植物的SSR聚類(lèi)圖Fig.5 The SSR dendrogram of 10 tested plants

4 結(jié)論

試驗(yàn)篩選出SSR適宜引物12對(duì)，PCR擴(kuò)增10個(gè)材料的基因組DNA共得到509個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性百分率達(dá)87.30%。每對(duì)引物擴(kuò)增的SSR指紋圖清晰、穩(wěn)定，是識(shí)別4個(gè)低氰含量高丹草新品系及其親本的重要分子依據(jù)。供試材料間的GD值變幅為0.3165～0.6692，以GD值0.50為基準(zhǔn)，10個(gè)材料劃分為5類(lèi):蒙農(nóng)青飼3號(hào)、散穗高粱、SLCN-11、SLCN-12、SLCN-13為一類(lèi);SLCN-14、棕殼蘇丹草為一類(lèi);白殼蘇丹草、黑殼蘇丹草、紅殼蘇丹草各單獨(dú)為一類(lèi)。

［1］詹秋文，錢(qián)章強(qiáng).高粱與蘇丹草雜種優(yōu)勢(shì)利用的研究［J］.作物學(xué)報(bào)，2004，30(1):73-77.

［2］李源，謝楠，趙海明.不同高丹草品種對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)及抗旱性評(píng)價(jià)［J］.草地學(xué)報(bào)，2010，18(6):891-896.

［3］趙曉杰，于卓，劉永偉，等.高粱314A、13A與蘇丹草雜種F1代的農(nóng)藝特性及細(xì)胞學(xué)分析［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2005，25(6):1107-1113.

［4］于卓，趙曉杰，趙娜，等.蒙農(nóng)青飼2號(hào)高丹草選育［J］.草地學(xué)報(bào)，2004，12(3):176-182.

［5］于卓，劉永偉，趙曉杰，等.高粱11A與3種蘇丹草雜交種F1的農(nóng)藝特性及細(xì)胞遺傳學(xué)研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(1):90-96.

［6］汪建飛，段立珍，羅自琴.雜交蘇丹草中CN－含量的測(cè)定［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11(1):43-46.

［7］周亞星.超低氫氰酸高丹草新品系分子標(biāo)記輔助選育研究［D］.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［8］周亞星，于卓，馬艷紅，等.散穗高粱與蘇丹草雜種的ISSR分析［J］.草地學(xué)報(bào)，2009，17(6):718-722.

［9］周亞星，于卓，房永雨，等.超低氫氰酸高丹草新品系選育及ISSR分子標(biāo)記驗(yàn)證［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2012，34(3):16-11.

［10］周亞星，于肖夏，于卓，等.高丹草超低氫氰酸含量ISSR特征片段的克隆及序列分析［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2012，34(6):75-80.

［11］羅冉，吳委林，張旸，等.SSR分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29(1):137-143.

［12］朱彩梅，張京.應(yīng)用SSR標(biāo)記分析中國(guó)糯大麥種質(zhì)的遺傳多樣性［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2010，11(1):57-64.

［13］盧玉飛，蔣建雄，易自力.玉米SSR引物和甘蔗EST引物在芒屬中的通用性研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21(5):86-95.

［14］吳元奇，鄭靈，榮廷昭.西南地區(qū)白玉米地方種質(zhì)資源分布及遺傳多樣性［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22(4):160-169.

［15］于卓，馬艷紅，李小雷，等.蒙農(nóng)3號(hào)高丹草選育［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2008，30(6):1-9.

［16］Nei M，Li W.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］.Proceedings National A-cademy Sciences USA，1979，76:5269-5273.

［17］鄧衍明，葉曉青，佘建明，等.植物遠(yuǎn)緣雜交育種研究進(jìn)展［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26(增刊):52-55.

［18］戴華軍，朱正斌，沈雪林，等.作物遠(yuǎn)緣雜交育種的途徑及其實(shí)質(zhì)［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29(1):144-149.