李雪萍，苗昌盛，朱恩作，賀春玲，李在留

（1.河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南 洛陽 471003；2. 廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530004）

野生瀕危掌葉木SRAP-PCR體系的建立與優(yōu)化

李雪萍1，苗昌盛1，朱恩作1，賀春玲1，李在留2

（1.河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南 洛陽 471003；2. 廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530004）

以野生瀕危植物掌葉木的葉片為材料，通過正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)相結(jié)合的方法，研究了模板DNA用量、Taq DNA 聚合酶用量、dNTP濃度、Mg2+濃度、引物濃度等因素對SRAP-PCR反應(yīng)的影響，建立了適宜于掌葉木SRAP分析的擴(kuò)增體系，即20 μL的反應(yīng)體系中含模板DNA約20 ng，Mg2+2.0 mmol/L，引物0.6 μmol/L，dNTP 0.20 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U。該研究為利用SRAP技術(shù)分析掌葉木遺傳多樣性、進(jìn)行掌葉木種質(zhì)資源相關(guān)研究等奠定了良好的基礎(chǔ)。

掌葉木；SRAP；PCR；優(yōu)化

掌葉木Handeliodendron bodinieri，我國特有的珍稀瀕危野生物種，無患子科Sapindaceae掌葉木屬Handeliodendron落葉大喬木，第三紀(jì)孑遺植物。該物種分布區(qū)域狹小，全球僅見我國貴州南部的荔波、獨(dú)山以及廣西隆林、田林、凌云等縣零星分布[1]。作為亞熱帶石灰?guī)r石山常綠、落葉闊葉混交林的特有樹種之一，其對古植物、古地理、古氣候的研究以及喀斯特地形地貌研究與保護(hù)具有重要意義[2-4]。

SRAP(Sequence-related amplified polymorphism，序列擴(kuò)增相關(guān)多態(tài)性）是Li和Quiros[5]發(fā)明的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，其原理是利用獨(dú)特的引物設(shè)計對ORFs（open reading frames, 開放閱讀框架）進(jìn)行擴(kuò)增。因其具有引物通用性、在基因組中分布均勻、多態(tài)性高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，近年來在遺傳多樣性分析、雜種鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面應(yīng)用廣泛[6-11]。

本研究對SRAP-PCR擴(kuò)增體系的相關(guān)影響因素進(jìn)行優(yōu)化篩選，建立適于掌葉木的簡單、高效、穩(wěn)定的SRAP反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開展野生瀕危植物掌葉木的種質(zhì)資源和分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)材料采自廣西省鳳山縣巴蠟猴山境內(nèi)，取其健康葉片，于冰壺中帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 原初SRAP反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增程序

采用申丹等[12]介紹的改良CTAB法，提取掌葉木的總DNA。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[13-19]，設(shè)其原初反應(yīng)體系（20 μL ）為： 30 ng模板DNA，2.0 mmol/L MgCl2，0.20 mmol/L dNTP，0.20 μmol/L Primer1，0.20 μmol/L Primer2，1×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶 1.0 U。初步反應(yīng)程序依照Li和Quiros的程序，即：94 ℃預(yù)變性5 min，然后先執(zhí)行5個擴(kuò)增循環(huán)，每個循環(huán)中，94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；再執(zhí)行35個循環(huán)，每個循環(huán)中，94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

引物采用通用SRAP的序列，由上海生工生物工程公司合成。擴(kuò)增反應(yīng)在SENSQUEST LAB CYCLER基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，所用Taq DNA聚合酶、dNTP均為Takara公司產(chǎn)品。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，3 V/cm恒定電壓下電泳約1.5 h，自動凝膠成像系統(tǒng)（UVItec）拍照記錄。

1.3 SRAP-PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化

為了確定最佳的掌葉木SRAP-PCR的擴(kuò)增條件，從4對SRAP引物（詳見表1）的16組引物組合中，初步選擇出譜帶多態(tài)性較高的通用引物Em3-Me1為引物，進(jìn)行4因素（Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶用量）4水平的正交優(yōu)化（見表2）及各因素的單因素試驗(yàn)（各因素變化量詳見表3）研究，在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對DNA模板用量亦進(jìn)行了5水平的試驗(yàn)。

表1 所用SRAP引物及其序列Table 1 List of SRAP primers used in study

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)

掌葉木SRAP-PCR體系中，Mg2+、dNTP、引物濃度及Taq DNA聚合酶用量的4因素4水平的正交優(yōu)化結(jié)果見圖1。參照何正文等[20]的方法，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行直觀分析，評定出第7泳道為最佳。即其對應(yīng)的擴(kuò)增體系（20 μL）為：Mg2+2.0 mmol/L，dNTP 0.20 mmol/L，引物 0.4 μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0 U。

表2 SRAP-PCR正交設(shè)計Table 2 SRAP-PCR orthogonal design used in study

表3 SRAP-PCR體系優(yōu)化的因素與水平Table 3 Factors and levels of SRAP-PCR system optimization

圖1 掌葉木的SRAP-PCR正交試驗(yàn)圖譜Fig.1 SRAP-PCR pattern for an orthogonal design of H. bodinieri

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 模板濃度的影響

在本研究所設(shè)定的5個DNA用量下，模板DNA的用量對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性有一定的影響。如圖2所示，雖然不同的模板DNA用量下均有擴(kuò)增產(chǎn)物，但存在一定差別；隨著DNA用量的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶逐漸減少；DNA用量在10～30 ng之間時，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目較多且比較清晰。因此，選擇模板DNA的最適用量為20 ng。

圖2 不同DNA用量對SRAP-PCR的影響Fig. 2 Effects of template DNA concentrations on SRAP-generated bands

2.2.2 Mg2+濃度的影響

Mg2+是Taq DNA聚合酶的激活劑，一般情況下，Mg2+不足時，Taq DNA聚合酶的作用效率降低，且dNTP競爭Mg2+，同時Mg2+受dNTP總量的影響。由圖3可以看出，在本研究中，當(dāng)Mg2+濃度較低（1.0 mmol/L）時，沒有擴(kuò)增條帶；當(dāng)Mg2+濃度高于2.0 mmol/L時，均能得到條帶清晰的譜帶。最終選擇Mg2+的濃度為2.0 mmol/L。

圖3 Mg2+濃度對SRAP-PCR的影響Fig.3 Effects of Mg2+ concentrations on SRAP-generatedbands

2.2.3 dNTP濃度的影響

dNTP作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原料，在PCR反應(yīng)中為Taq DNA聚合酶提供底物。dNTP濃度過低時，可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的減少；濃度過高時，則會增加錯誤率，同時會與Taq DNA聚合酶競爭Mg2+，引起反應(yīng)中Mg2+總量的下降，從而抑制Taq DNA聚合酶的活性，影響擴(kuò)增效率，甚至?xí)柚狗磻?yīng)進(jìn)行。

試驗(yàn)結(jié)果（見圖4）表明，當(dāng)dNTP濃度在0.10～0.30 mmol/L之間時，隨著其濃度的增加，擴(kuò)增條帶由弱到強(qiáng)；dNTP濃度為0.40～0.50 mmol/L時，譜帶反而消失成彌散狀。因此，選擇使用0.20 mmol/L為dNTP的最適濃度。

圖4 dNTP濃度對SRAP-PCR的影響Fig.4 Effects of dNTP concentrations on SRAP-generated bands

2.2.4 引物濃度的影響

引物的選擇及用量影響著特異性條帶的清晰度。引物用量較小時，其與模板DNA的結(jié)合效率較低，產(chǎn)物的產(chǎn)量會受到影響；但引物濃度過大時，會增加非特異性擴(kuò)增，引物二聚體的形成概率增加，以及與Taq DNA聚合酶競爭影響其與Mg2+結(jié)合的幾率。如圖5所示，在0.2～1.0 μmol/L的引物范圍內(nèi)，均能得到相似的擴(kuò)增條帶，僅當(dāng)引物濃度為0.2 μmol/L時，擴(kuò)增出的條帶稍有模糊。綜合考慮，確定0.6 μmol/L為引物最適濃度。

圖5 引物濃度對SRAP-PCR的影響Fig. 5 Effects of primers concentrations on SRAP-generated bands

2.2.5 Taq DNA聚合酶用量

一般認(rèn)為，Taq DNA聚合酶用量過高會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，同時試驗(yàn)成本較高；但濃度過小會影響擴(kuò)增效率，降低擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。在本研究中，Taq DNA聚合酶5個梯度用量下，都有條帶擴(kuò)出：當(dāng)Taq DNA聚合酶用量為0.5 U時，擴(kuò)增條帶相對較弱；其余4個用量下，所得條帶均較清晰，差異不大（見圖6）。考慮到成本問題，將1.5 U確定為Taq DNA聚合酶的適宜用量。

圖6 Taq酶用量對SRAP-PCR的影響Fig. 6 Effects of TaqDNA polymerase dosages on SRAP-generated bands

3 結(jié) 論

本研究通過單因素、正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對PCR擴(kuò)增體系中的Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度及Taq DNA聚合酶等影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立起重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的適于掌葉木SRAPPCR的反應(yīng)體系，即 20 μL體系中，模板用量為20 ng，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，引物濃度為0.6 μmol/L，dNTP濃度為 0.20 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U。該研究為今后開展野生瀕危植物掌葉木的相關(guān)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Establishment and optimization of SRAP-PCR amplification system in Handeliodendron bodinieri

LI Xue-ping1, MIAO Chang-sheng1, ZHU En-zuo1, HE Chun-ling1, LI Zai-liu2
(1. College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China; 2. College of Forestry, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi, China)

In order to establish an optimal reaction system of SRAP-PCR in Handeliodendron bodinieri, the effects of main elements,such as template DNA concentration, Taq DNA polymerase dosage, dNTP concentration, Mg2+concentration, primer concentration on SRAP-PCR reaction were investigated by an orthogonal design and single factor experiments respectively. The optimal reaction system for SRAP analysis in H. bodinieri was obtained. It consisted of 20 ng template DNA, 1×PCR buffer, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.20 mmol/L each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 1.5 unit of Taq DNA polymerase and 0.6 μmol/L primer in a total volume of 20 μL. The study lays a good foundation for SRAP analysis in H. bodinieri.

Handeliodendron bodinieri; SRAP; PCR; optimization

S759.95；Q948

A

1673-923X(2013)09-0018-04

2013-02-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060053）；河南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（62580021）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011GXNSFB018016）

李雪萍（1980-），女，河南洛陽人，講師，博士，從事瀕危植物遺傳多樣性研究；E-mail：L_XX_P_98000@163.com

李在留（1979-），女，云南宣威人，副教授，博士，從事瀕危植物的瀕危機(jī)制研究；E-mail：lizailiu666@163.com

[本文編校：謝榮秀]