夏陽(yáng)陽(yáng)，蔣春明，孫琤，于立杰，張苗

(1.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210008;2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南京 210008)

目前臨床廣泛使用的葡萄糖腹膜透析液(PDF)具有明顯的非生物相容性，長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致腹膜損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腹膜纖維化。腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生凋亡是腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展重要機(jī)制之一。目前研究表明，葡萄糖PDF可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡［1-2］。以往研究證實(shí)，丹參酮ⅡA(TSN)在體內(nèi)、外具有顯著抑制多種細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用［3-4］。本研究主要通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)干預(yù)，旨在了解TSN能否通過(guò)抑制PDF誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下調(diào)人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)凋亡因子的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

正常澳洲胎牛血清、High-glucose DEME培養(yǎng)基、0.25%EDTA-Trypsin均購(gòu)自GIBCO公司(Great Island，紐約，美國(guó));丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;Trizol以及引物購(gòu)自invitrogen公司(Carlsbad，加利福尼亞洲，美國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄及Real-time-PCR反應(yīng)試劑盒為日本TAKARA公司(大連，中國(guó))產(chǎn)品;兔抗人 bcl-2、bax抗體購(gòu)自 Cell Signaling公司(Boston，波士頓，美國(guó))，鼠抗人caspase-3抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(海門(mén)，中國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IGg抗體購(gòu)自Cell Signaling公司(Boston，波士頓，美國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IGg抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(海門(mén)，中國(guó));4.25%PDF為廣州百特醫(yī)療用品公司(廣州，中國(guó))產(chǎn)品，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液為江蘇科菲平醫(yī)藥有限公司(南京，中國(guó))產(chǎn)品，30%過(guò)氧化氫為南京寧試化學(xué)試劑有限公司(南京，中國(guó))產(chǎn)品。

1.2 HPMCs的培養(yǎng)與鑒定

取3位擇期腹部手術(shù)(非尿毒癥、糖尿病、腫瘤、腹膜炎)患者的大網(wǎng)膜組織，按文獻(xiàn)［5］方法原代培養(yǎng)HPMCs，按1∶3傳代，第3代用于實(shí)驗(yàn)，傳代細(xì)胞經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，免疫組化鑒定抗細(xì)胞角蛋白抗體陽(yáng)性、抗波形蛋白染色陽(yáng)性、抗Ⅷ因子抗體陰性、抗白細(xì)胞CD45抗體染色陰性。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)分組:用含10%胎牛血清的High-glucose DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HPMCs，放置于含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。同步培養(yǎng)24 h后分為5組:對(duì)照組(DEME培養(yǎng)基)、PDF組(4.25%PDF)、TSN組(含TSN終濃度為100μmol·L-1的 DEME培養(yǎng)基)、TSN低濃度組(含TSN 終濃度為50 μmol·L-1的4.25%PDF)、TSN高濃度組(含TSN終濃度為100μmol·L-1的4.25%PDF)，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡因子檢測(cè)分組:按照上述培養(yǎng)方法同步培養(yǎng)后分為5組:對(duì)照組(DEME 培養(yǎng)基)、H2O2組(3%H2O2)、TSN+H2O2組(含TSN終濃度為50μmol·L-1的3%H2O2)、PDF組(4.25%PDF)、TSN+PDF組(含TSN 終濃度為50μmol·L-1的4.25%PDF)，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 上清液中MAD、SOD、GSH濃度檢測(cè) 取各組細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，將其保存于-20℃冰箱。按照試劑盒說(shuō)明分別用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝酸苯甲酸顯色法檢測(cè)上清液MDA、SOD、GSH濃度。

1.3.3 Real time PCR 法檢測(cè) bax、caspase-3、bcl-2 基因的表達(dá) 用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，1μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，20 μl的 bax、caspase-3、bcl-2 反應(yīng)體系用于PCR擴(kuò)增。反應(yīng)在7500Real-time-PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件:95℃ 30 s，預(yù)變性，1個(gè)循環(huán);95℃ 5 s，65℃ 34 s，PCR反應(yīng)，共40個(gè)循環(huán)。使用GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)2—ΔΔCT方法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)比值。Real time PCR引物序列見(jiàn)表1。

1.3.4 Western Blot法檢測(cè) bax、caspase-3、bcl-2 蛋白表達(dá) 用RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，按BCA試劑盒(凱基生物公司)說(shuō)明采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白樣品，進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，放入5%脫脂牛奶在搖床上緩慢搖動(dòng)，進(jìn)行室溫封閉60 min。然后加入兔抗人抗體bcl-2、bax(1∶1 000 稀釋)、鼠抗人抗體 caspase-3(1∶500稀釋)和 GAPDH(1∶5 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用TBST洗膜，每次10 min，共4次，然后加入相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記羊抗兔IGg抗體和HRP標(biāo)記羊抗鼠IGg抗體，室溫孵育2 h。再次用同樣方法洗膜后加入ECL顯色液進(jìn)行顯色，曝光。使用Quantity one分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值為所測(cè)蛋白的相對(duì)含量。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析;兩組間比較采用LSD法檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 上清液中氧化應(yīng)激指標(biāo)MAD、SOD、GSH濃度檢測(cè)結(jié)果

各組上清中 MDA、SOD、GSH的含量見(jiàn)表2。其中，PDF組 MDA的含量較對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)，SOD、GSH的含量顯著降低(P＜0.01)。與PDF組比較，加入不同濃度TSN的PDF組的MDA含量都明顯降低(P＜0.01)，SOD、GSH的含量都顯著升高(P＜0.01)，但未發(fā)現(xiàn)與 TSN濃度高低(50、100μmol·L-1)存在劑量依賴關(guān)系(P＞0.05)。

表2 上清液中MDA、SOD、GSH的水平Tab 2 The levels of MAD，SOD，GSH in the supernatant

2.2 Real time PCR結(jié)果

與對(duì)照組比較，H2O2組和PDF組的bax、caspase-3的 mRNA表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)，bcl-2的mRNA表達(dá)量顯著減少(P＜0.01)。與H2O2組比較，TSN+H2O2組 bax、caspase-3的 mRNA表達(dá)量減少(P＜0.01)，bcl-2的mRNA表達(dá)量增加(P＜0.01)。與PDF組比較，TSN+PDF組bax、caspase-3的mRNA表達(dá)量減少(P＜0.01)，bcl-2的mRNA表達(dá)量增加(P＜0.01)。bax、caspase-3、bcl-2的 mRNA 表達(dá)情況及定量分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 bax、caspase-3、bcl-2 mRNA Real time PCR 分析結(jié)果Fig 1 Real-time quantitative analysis of bax，caspase-3，bcl-2 mRNA

2.3 Western Bolt結(jié)果

與對(duì)照組比較，H2O2組和PDF組bax、caspase-3的蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)，bcl-2的蛋白表達(dá)量顯著減少(P＜0.01)。與H2O2組比較，TSN+H2O2組bax、caspase-3的蛋白表達(dá)量減少(P＜0.01)，bcl-2的蛋白表達(dá)量增加(P＜0.01)。與PDF組比較，TSN+PDF組bax、caspase-3的蛋白表達(dá)量減少(P＜0.01)，bcl-2的蛋白表達(dá)量增加(P＜0.01)。bax、caspase-3、bcl-2蛋白表達(dá)情況及定量分析結(jié)果見(jiàn)圖2～4。

圖2 bax蛋白印跡分析結(jié)果Fig 2 Western Blot analysis of bax

圖3 caspase-3蛋白印跡分析結(jié)果Fig 3 Western Blot analysis of caspase-3

3 討 論

圖4 bcl-2蛋白印跡分析結(jié)果Fig 4 Western Blot analysis of bcl-2

長(zhǎng)期使用非生物相容PDF可以導(dǎo)致腹膜纖維化。目前研究表明，腹膜纖維化的發(fā)生與PDF所導(dǎo)致的HPMCs凋亡密切相關(guān)。凋亡因子表達(dá)上調(diào)可以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。既往已有研究表明PDF可以誘導(dǎo)腹腔發(fā)生氧化應(yīng)激［6］，是上調(diào)凋亡因子表達(dá)的重要因素之一。Kapoor等［7］研究表明，使用抗氧化劑可以抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激并下調(diào)凋亡因子的表達(dá)。TSN是一種新型有效的抗氧化劑，已被證實(shí)具有明顯的抗氧化、清除自由基和保護(hù)細(xì)胞功能等作用［8-9］。作者旨在研究TSN是否具有抑制PDF誘導(dǎo)的HPMCs氧化應(yīng)激并下調(diào)細(xì)胞凋亡因子表達(dá)的作用。

以往的研究表明，非生物相容性透析液導(dǎo)致的腹膜損傷與腹腔高氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)［10］。Diaz-Buxo等［11］通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型的研究表明，使用非生物相容性的PDF 30 d后大鼠腹腔內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)顯著升高，腹膜硬化明顯，且腹膜超濾功能顯著降低，提示氧化應(yīng)激在腹膜損傷中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在含有高糖PDF的刺激下，培養(yǎng)細(xì)胞HPMCs的上清液中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA濃度顯著高于對(duì)照組，SOD、GSH濃度顯著低于對(duì)照組，表明高糖PDF可以誘導(dǎo)HPMCs氧化應(yīng)激發(fā)生。在添加TSN后氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA濃度顯著降低，SOD、GSH濃度顯著升高，提示TSN在體外的確具有抑制PDF誘導(dǎo)HPMCs氧化應(yīng)激作用。

細(xì)胞發(fā)生凋亡是氧化應(yīng)激損傷的重要后果之一，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基可以使生物膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性以及線粒體損傷，從而使凋亡因子bax、caspase-3釋放到細(xì)胞漿內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡［12-13］。以往研究證實(shí)，生物非相容PDF可以導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞凋亡。Boulanger等［14］通過(guò)使用不同濃度葡萄糖的透析液與HPMCs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，HPMCs的凋亡率與透析液葡萄糖濃度成正比。本研究亦發(fā)現(xiàn)加入高糖PDF后，HPMCs的凋亡因子mRNA及蛋白含量顯著高于對(duì)照組，抑制凋亡因子mRNA及蛋白的含量顯著低于對(duì)照組，證實(shí)高糖PDF可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞凋亡。在添加TSN后，HPMCs的凋亡因子mRNA及蛋白含量顯著低于PDF組，抑制凋亡因子mRNA及蛋白的含量顯著高于PDF組，表明TNN具有抑制PDF誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞凋亡作用。

本實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了H2O2組和TSN+H2O2組，以進(jìn)一步探討TSN抑制細(xì)胞凋亡的作用是否與其抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)H2O2組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡因子bax、caspase-3表達(dá)增多，抑制凋亡因子bcl-2表達(dá)降低，提示氧化應(yīng)激的確可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞凋亡。加入TSN后，和H2O2組相比，細(xì)胞凋亡因子bax、caspase-3表達(dá)顯著減少，抑制凋亡因子bcl-2表達(dá)顯著增多，表明丹參酮可以有效抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞凋亡。因此，丹參酮對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷兩方面實(shí)現(xiàn)的。

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