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簡單快速的多糖植物雙生病毒核酸提取方法

2013-12-23 05:18郭靈芳張長青魯紅學(xué)孫正祥章松柏張友軍吳祖建
實驗技術(shù)與管理 2013年6期
關(guān)鍵詞:雙生病株核酸

郭靈芳,張長青,魯紅學(xué),孫正祥,章松柏,張友軍,吳祖建

(1.長江大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院,湖北荊州 434020;2.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北荊州 434025;3.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所,福建福州 350002;4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

1 雙生病毒

雙生病毒(geminiviruse)是植物病毒中唯一的一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA 病毒,病毒粒子的大小約為18nm×30nm,無包膜,基因組為單組分或雙組分結(jié)構(gòu),大小為2.5~3.0kb,通常由昆蟲介體以持久性方式傳播,大多侵染寄主植物的韌皮部組織[1-3]。雙生病毒一般發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū),溫帶地區(qū)也偶有發(fā)生。20世紀(jì)90年代后該病毒在世界范圍內(nèi)大面積爆發(fā),并在多種重要作物上引起嚴(yán)重危害,其中番茄、木薯、棉花和煙草是遭受雙生病毒危害最嚴(yán)重的作物,給種植者造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。20世紀(jì)90年代以前,雙生病毒引起的病害在我國發(fā)生范圍小、危害不大。但90年代以后,廣西、云南等地相繼發(fā)現(xiàn)煙草、番茄、南瓜和番木瓜等作物遭受雙生病毒危害,并且發(fā)生范圍逐年擴(kuò)大,危害程度日益加深,如:廣西的番木瓜和番茄發(fā)病普遍,發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)病株率高達(dá)30%~50%[5-8];2006年上海和浙江先后發(fā)現(xiàn)雙生病毒危害番茄后,該病害在華東地區(qū)迅速蔓延開來,造成嚴(yán)重危害[9]。

隨著雙生病毒危害的加重,快速檢測和鑒定病原十分必要。目前應(yīng)用于雙生病毒的檢測手段主要有血清學(xué)方法、核酸雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、RCA(rolling circle amplifieation)等方法。盡管已經(jīng)得到了一些雙生病毒的多克隆抗體或單克隆抗體,但由于雙生病毒血清關(guān)系有遠(yuǎn)有近,限制了血清學(xué)方法的應(yīng)用[10]。核酸雜交、PCR、RCA 3種方法都基于雙生病毒基因組核酸的方法,比較特異和靈敏,廣泛應(yīng)用于雙生病毒的檢測和鑒定。雙生病毒基因組核酸的提取質(zhì)量對檢測結(jié)果影響很大,特別是從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質(zhì)的植物中提取的雙生病毒基因組核酸。從這些植物中分離出的DNA 由于多酚被氧化成棕褐色,多糖、單寧等物質(zhì)與DNA 會結(jié)合成黏稠的膠狀物,獲得的DNA 常出現(xiàn)產(chǎn)量低、質(zhì)量差、易降解等問題,影響DNA 質(zhì)量和純度,不能被限制性內(nèi)切酶酶切,嚴(yán)重的甚至不能作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[11-13]。此外,雙生病毒基因組是單鏈環(huán)狀的DNA,在大小和性質(zhì)上都與寄主基因組DNA 不同,完全用植物基因組DNA 的提取方法提取雙生病毒基因組,可能會對其產(chǎn)率有一定的影響?;诖耍趥鹘y(tǒng)雙生病毒基因核酸提取方法的基礎(chǔ)上,結(jié)合總DNA 提取的CTAB 法和質(zhì)粒提取的離心柱方法,探索一種簡單快速的多糖多酚植物雙生病毒基因組核酸的提取方法。

2 材料與方法

2.1 材料

植物樣品:朱槿曲葉病病株和朱槿健株,病株和健株葉片采集于福建省福州市郊區(qū),經(jīng)過鑒定(病毒為Cotton leaf curl Multan virus)后保存于-70 ℃超低溫冰箱中備用。

2.2 CTAB法提取植物的總DNA

取約0.1g朱槿葉片(病株葉片3 份,即3 次重復(fù)),在液氮中研磨成粉末,加入700μL、65 ℃預(yù)熱的2×CTAB提取緩沖液,溫和混勻;65 ℃保溫30~60 min,期間不時搖動,使其充分混勻;用等體積的24∶1氯仿/異戊醇抽提勻漿液,顛倒使充分混合,于室溫下10 000r/min離心10min,回收水(上)相;用等體積的氯仿/異戊醇抽提,顛倒混勻,離心,回收上層水相;取上清,加入等體積的異丙醇,混勻,-20 ℃放置20min后12 000r/min離心10min以沉淀DNA;棄掉上清,加入適量的75%乙醇清洗、沉淀一次,隨后12 000 r/min離心10min;棄掉上清液,干燥后加入50μL 的TE溶液以溶解DNA,-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 離心柱法提取植物的總DNA

選用特別適用于多酚、多糖含量高的植物組織的植物總DNA 提取試劑盒DP305-02(北京天根生化科技有限公司),具體操作見說明書,朱槿葉片取0.1g(健株葉片1份、病株葉片3份,即3次重復(fù)),最后用50μL TE溶液溶解DNA,-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 改進(jìn)后的植物總DNA提取方法

取約0.1g 朱槿葉片(病株葉片3 份即3 次重復(fù)),在液氮中研磨成粉末,加入700μL、65 ℃預(yù)熱的2×CTAB提取緩沖液,溫和混勻;65 ℃保溫30min,期間不時搖動,使其充分混勻;用等體積的24∶1 氯仿/異戊醇抽提勻漿液,顛倒使充分混合,于室溫10 000r/min離心10min,回收水(上)相;加入0.7倍體積的A 溶液(4~5 mol/L 鹽酸胍,0.75 mol/L KAc,pH=4.2~4.6),混勻;將混勻后的溶液加入離心柱(質(zhì)粒小提試劑盒DP103,北京天根生化科技有限公司)中,后面步驟參照質(zhì)粒小提試劑盒說明書;最后用50μL TE溶液溶解DNA,-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 PCR 檢測和靈敏性分析

以上述3種方法提取的植物總DNA 為模板,進(jìn)行PCR 檢測,引物引用謝艷等根據(jù)雙生病毒共同區(qū)及外殼蛋白基因保守序列設(shè)計的簡并引物PA 和PB,擴(kuò)增片段大小為500bp。

PCR 檢測:PCR 反應(yīng)體系按照TaKaRa的rTaq酶使用說明進(jìn)行,反應(yīng)程序為:94 ℃變性4min,35個循環(huán)的擴(kuò)增(94 ℃30s,52 ℃20s,72 ℃30min),最后72 ℃延伸10min,8 ℃保存20h。

靈敏性分析:取2.4節(jié)中獲取的DNA 4μL,進(jìn)行1、10、100、1 000、10 000 倍稀釋,然后按上述的PCR程序進(jìn)行實驗,以檢測改進(jìn)后的植物總DNA 提取方法的靈敏性。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,EB 染色后BioRad凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

2.6 Real Time PCR 反應(yīng)

根據(jù)實驗室已測定的木爾坦棉花曲葉病毒DNAA 組分設(shè)計熒光定量引物,篩選得到擴(kuò)增效率高、反應(yīng)特異性強(qiáng)的一對引物 DLF/DLR(5′-CTGCCGAAGTTCAGACGCC-3′ 和 5′-CAGGATTATTCACCGGATACCCTA-3′),擴(kuò)增片段大小為147 bp。上述3種方法提取的DNA 各取2μL,稀釋100倍后使用。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII(TaKaRa Code:DRR081)試劑盒操作說明配制反應(yīng)液。用離心機(jī)快速離心含有反應(yīng)液的PCR 反應(yīng)管后,放入Eppendorf Realplex System 中,然后運行程序,采用兩步法進(jìn)行Real Time PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件如下:預(yù)變性,95 ℃30s,95 ℃5s,60 ℃30s,40個循環(huán)。為了建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從60 ℃緩慢加熱到95℃(每2s升高0.2 ℃)。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR 檢測結(jié)果

以上述3種方法提取的植物總DNA 為模板,進(jìn)行PCR 檢測,引物引用謝艷等[7]設(shè)計的通用簡并引物PA 和PB,結(jié)果如圖1(a),均能擴(kuò)增到預(yù)期的500bp大小的片段。說明3種方法均有效地抽提到雙生病毒的基因組核酸,改進(jìn)的方法和另外兩種方法一樣可以應(yīng)用。為了驗證改進(jìn)方法的靈敏性,以改進(jìn)后的方法提取的植物總DNA 為模板,依次稀釋1、10、100、1 000、10 000后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果如圖1(b),在PCR 反應(yīng)程序為35 個循環(huán)的條件下,模板稀釋1 000倍的情況下依然可以得到預(yù)期的片段,顯示改進(jìn)的方法有較高的靈敏度。

圖1中M 為DNA 標(biāo)記。圖1(a)中:1為陽性對照;2為陰性對照;3—5 為以CTAB 法提取植物的總DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增;6—8為以離心柱法提取植物的總DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增,9—11為改進(jìn)后的方法提取的植物總DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。圖1(b)中:1-5為以改進(jìn)后的方法提取的植物總DNA為模板,依次稀釋1、10、100、、10 000后進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。

圖1 PCR 檢測

3.2 Real Time PCR 反應(yīng)結(jié)果

靈敏度分析只能定性地說明改進(jìn)后的方法可行,有較高的靈敏度,但無法比較3種方法的優(yōu)劣。為了比較3種方法提取雙生病毒基因組核酸的效率,采用熒光定量PCR 的方法進(jìn)行分析,結(jié)果見圖2。從圖2中可知,對于雙生病毒基因組產(chǎn)率來說,3 種方法中CTAB法效率最低,離心柱法次之,改進(jìn)方法最高。時間和價格比較見表1。從表1的數(shù)據(jù)來看,改進(jìn)后的方法在價格和時間上也有一定優(yōu)勢。

圖2 3種方法提取雙生病毒基因組核酸的效率比較

表1 3種方法提取雙生病毒基因組核酸的比較

4 討論

一些植物,如番茄、朱槿等,都富含多糖物質(zhì),從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質(zhì)的植物中提取總DNA 的方法難度相對大于大多數(shù)的禾谷類及蔬菜類植物。從富含多糖的植物中提取DNA 時,由于多糖、單寧等物質(zhì)與DNA 會結(jié)合成黏稠的膠狀物,不易分離,常導(dǎo)致總DNA 產(chǎn)量低、質(zhì)量差、易降解等問題,影響了DNA 質(zhì)量和純度,嚴(yán)重的甚至不能作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。因此,一旦處理不好,對實驗檢測或鑒定結(jié)果影響較大。傳統(tǒng)的CTAB 法提取總DNA 時,為了獲得更多的病毒基因組,多采用增加實驗材料,先大量抽提、隨后濃縮的方法[14],這樣對儀器和實驗時間的要求必然增加。植物總DNA 提取的離心柱法提取總DNA 的效果較好,但是處理每個樣品的價格較貴(7 元/樣品),因而每個樣品質(zhì)量受限制(小于0.1g),最后得到的雙生病毒基因組量也有限。此外,植物總DNA 提取的離心柱法主要針對寄主的染色體DNA,而雙生病毒基因組是單鏈環(huán)狀的DNA,在大小和性質(zhì)上都與寄主基因組DNA 有一定的差異,跟雙鏈環(huán)狀的質(zhì)粒更接近,所以用該方法提取雙生病毒基因組可能會對其產(chǎn)率有一定的影響??紤]到以上兩個方面的因素,在傳統(tǒng)雙生病毒基因核酸提取方法的基礎(chǔ)上,結(jié)合總DNA 提取的CTAB 法和質(zhì)粒提取的離心柱方法,發(fā)展了簡單快速的多糖植物雙生病毒基因組核酸的提取方法。從所得的數(shù)據(jù)來看,改進(jìn)后的方法無論在靈敏度、時間、價格和產(chǎn)率上都具有一定的優(yōu)勢,說明更適合于雙生病毒基因組核酸的提取和應(yīng)用。

[1]Goodman R M.Single-stranded DNA genome in a whitefly-transmitted plant virus[J].Virology,1977,83:171-179.

[2]Rock K R,Guthrie R J,Woods R D.Purification of maize streak virus and its relationship to streak diseases of sugar cane and Panicum maximum[J].Ann Appl Biol,1994,77:289-296.

[3]洪健,李德葆,周雪平.植物病毒分類圖譜[M].北京:科學(xué)出版社,2001:28-38.

[4]Boulton M I.Geminiviurses:Major threats to world agriculutre[J].Ann Appl Biol,2003:142(4):143.

[5]張穎,殷勤燕,劉玉樂,等.中國煙草曲葉病毒廣西株的初步研究[J].中國病毒學(xué),2000,15(4):405-408.

[6]Zhou X P,Xie Y,Zhang Z K.Molecular characterization of a distinct begomovirus infecting tobacco in Yunnan,China[J].Archives of Virology,2001,146(9):1599-1606.

[7]Xie Y,Zhou X P.Molecular characterization of squash leaf curl Yunnan virus,a new begomovirus and evidence for recombination[J].Archives of Virology,2003,148(10):2047-2054.

[8]Li Z H,Zhou X P,Zhang X,et al.Molecular characterization of tomato-infecting begomoviruses in Yunnan,China[J].Archives of Virology,2004.149(9):1721-1732.

[9]Wu J B,Dai E M,Zhou X P.First Report of Tomato yellow leaf curl virus in China[J].Plant Disease,2006,90(10):1359.

[10]楊彩霞.福建省六種雙生病毒的分子鑒定及RaMoV NSP互作蛋白的篩選[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2009.

[11]易慶平,羅正榮,張青林.植物總基因組DNA 提取純化方法綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(25):7789-7791.

[12]魏勝華,孟娜.改良CTAB法提取大戟屬藥用植物葉片總DNA 試驗[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,50(16):3148-3150.

[13]黃萱,高麗美,張永彥,等.一種優(yōu)化的植物總DNA 提取方法[J].西北植物學(xué)報,2004,24(6):1103-1106.

[14]李靜.我國六種雙生病毒的分子鑒定及兩種病毒的致病性研究[D].杭州:浙江大學(xué),2010.

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