張艷萍，崔 鵬，韓淑英，趙 靜，孫瑞軍，江春花，喇孝謹(jǐn)，李繼安*

1河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，唐山063000 ;2 河北省遷安市中醫(yī)醫(yī)院，遷安064400;3 河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，唐山063000

糖尿病(diabetes mellitus)是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病群，除碳水化合物外，尚有蛋白質(zhì)、脂肪代謝異常，其中2 型糖尿病發(fā)病率占DM 發(fā)病率90%～95%［1］，其病理生理基礎(chǔ)是胰島素抵抗和胰島β 細(xì)胞功能受損，胰島β 細(xì)胞功能損傷是糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素，干預(yù)胰島β 細(xì)胞功能受損成為治療2 型糖尿病的新趨勢。我們根據(jù)中醫(yī)文獻(xiàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝腎陰虛是2 型糖尿病主要病機(jī)之一［2］，為此擬定了代平顆粒組方，采用高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)尾靜脈注射方法建立2 型糖尿病大鼠模型，觀察其對大鼠糖脂代謝、氧化應(yīng)激和胰腺組織的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體重(180 ±220)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2006-0009。按每籠5 只喂養(yǎng)，自由飲水和攝食，室溫20～25 ℃，相對濕度(60 ±5)%，12 h/12 h 晝夜規(guī)律。

1.2 藥物與試劑

代平顆粒由桑葉、制首烏、桑椹、銀耳組成，于河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室按設(shè)計(jì)工藝提取并制成顆粒劑(出膏率27%)。二甲雙胍片(上海中美施寶有限公司);STZ(Sigma 公司)。丙二醛試劑盒，超氧化物歧化酶試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器

AGM－2300 血糖儀(韓國ALL Medicus 有限公司);酶標(biāo)儀(美國)。

2 方法

2.1 2 型糖尿病大鼠模型建立與分組給藥方法

50 只健康雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分出正常對照組(NC)8 只，喂以基礎(chǔ)飼料，其余42只大鼠喂以高脂飼料(脂肪41%、蛋白17%、碳水化合物42%)，自由進(jìn)食飲水。4 周后，大鼠禁食12 h，喂高脂飼料組大鼠按25 mg/kg 一次性尾靜脈注射2%STZ 溶液，臨用前用檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液配制。NC 組注射相當(dāng)劑量的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液。5 d 后大鼠斷尾取血測定空腹血糖(fast blood glucose，F(xiàn)BG)，以FBG≥11.1 mmol/L 為糖尿病大鼠，隨機(jī)分成糖尿病模型組(M)、二甲雙胍組(Met)、代平顆粒低劑量組(DL)、代平顆粒高劑量組(DH)。模型成功后次日以灌胃方式給藥，Met 組給藥量為0.14 g/kg·d，DL 組、DH 組給藥量分別為1.5 g/kg·d，6 g /kg·d(生藥)，NC 組和M 組以等量純凈水灌胃，共4 周。

2.2 標(biāo)本采集

用藥治療4 周后，所有大鼠空腹8 h 后稱重，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清儲(chǔ)存于-20 ℃;剖腹取胰腺，置于4%多聚甲醛中固定。

2.3 指標(biāo)檢測方法

2.3.1 空腹血糖檢測

各組大鼠于給藥前、給藥后2 周和4 周，空腹12 h 后斷尾采血，分別用快速血糖測試儀測定血糖。

2.3.2 血脂檢測

甘油三脂(TG)，總膽固醇(TC)，低密度脂蛋白(LDL-C)，高密度脂蛋白(HDL-C)于河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測。

2.3.3 血清SOD、MDA 檢測

用黃嘌呤氧化酶法檢測血清中SOD 活性;用硫代巴比妥酸法(TBA)檢測血清中MDA 含量(參考說明書操作)。

2.4 胰腺組織病理觀察

將胰腺組織取出，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成4 μm 切片，經(jīng)HE 染色后，在光鏡下觀察胰腺組織的病理形態(tài)學(xué)改變。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠FBG 的影響

與正常組比較，模型組大鼠FBG 水平顯著升高(P ＜0.01)，說明糖尿病模型制備成功;與模型組比較，給藥第2、4 周，二甲雙胍組、代平顆粒高劑量組大鼠FBG 水平顯著降低(P ＜0. 01 或P ＜0.05)，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，代平顆粒低劑量組FBG 有下降趨勢，結(jié)果表明代平顆粒具有降低FBG 的作用，其降糖作用隨劑量增加而增加(見表1)。

表1 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響(±s，mmol/L)Table 1 Effect of Daiping Granules on FBG of rats with type 2 diabetes (±s，mmol/L)

表1 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響(±s，mmol/L)Table 1 Effect of Daiping Granules on FBG of rats with type 2 diabetes (±s，mmol/L)

注:與NC 組比較，* P ＜0.01;與M 組比較，△P ＜0.01。Note:* P ＜0.01，compared with NC group;△P ＜0.01，compared with M group.

Group n 劑量Dose(g/kg·d) 給藥前Before 給藥后After 2 weeks 4 weeks NC 8－6.49 ±0.78 6.00 ±0.94 6.04 ±0.59 M 8－22.49 ±5.67* 22.20 ±5.02* 20.5 ±5.50*Met 8 0.14 23.71 ±5.83* 14.69 ±4.49△ 12.75 ±3.90△DL 8 1.5 22.73 ±6.24* 18.23 ±6.53 16.51 ±4.60 DH 8 6 23.01 ±5.46* 14.30 ±4.42△ 11.21 ±2.95△

3.2 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血脂代謝的影響

與正常組比較，模型組大鼠TG，TC，LDL-C 水平顯著升高(P ＜0.01)，HDL-C 水平顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，二甲雙胍組、代平顆粒高劑量組TG，TC，LDL-C 水平顯著降低(P ＜0.01 或P ＜0.05)，HDL-C 水平顯著升高(P ＜0.01 或P＜0.05)，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示代平顆粒高劑量組能調(diào)節(jié)血脂代謝(見表2)。

表2 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血脂的影響(±s，mmol/L)Table 2 Effect of Daiping Granules on serum lipid of rats with type 2 diabetes (±s，mmol/L)

表2 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血脂的影響(±s，mmol/L)Table 2 Effect of Daiping Granules on serum lipid of rats with type 2 diabetes (±s，mmol/L)

注:與NC 組比較，* P ＜0.01;與M 組比較，▲P ＜0.01，△P ＜0.05。Note:* P ＜0.01，compared with NC group;▲P ＜0.01，△P ＜0.05，compared with M group.

Group n TG TC LDL-C HDL-C NC 8 0.44 ±0.10 1.40 ±0.26 0.81 ±0.24 0.39 ±0.04 M 8 0.88 ±0.25* 2.02 ±0.42* 1.36 ±0.36* 0.28 ±0.09*Met 8 0.44 ±0.14▲ 1.44 ±0.19▲ 0.85 ±0.21▲ 0.40 ±0.08▲DL 8 0.71 ±0.23 1.74 ±0.35 1.09 ±0.44 0.33 ±0.10 DH 8 0.56 ±0.19▲ 1.56 ±0.29▲ 0.94 ±0.36△ 0.37 ±0.09△

3.3 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血清SOD 活性和MDA 含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中SOD 的活性明顯下降(P ＜0.01)，MDA 含量明顯增加(P ＜0.01);與模型組比較，二甲雙胍組、代平顆粒高劑量組SOD 水平顯著升高(P ＜0.01)，MDA 水平顯著降低(P ＜0.01)，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示代平顆粒具有一定的抗氧化能力。(見表3)

表3 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血清SOD 和MDA 的影響(±s)Table 3 Effect of Daiping Granules on the levels of SOD and MDA of rats with type 2 diabetes (±s)

表3 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠血清SOD 和MDA 的影響(±s)Table 3 Effect of Daiping Granules on the levels of SOD and MDA of rats with type 2 diabetes (±s)

注:與NC 組比較，* P ＜0.01;與M 組比較，▲P ＜0.01。Note:* P ＜0. 01，compared with NC group;▲P ＜0. 01，compared with M group.

Group n SOD(u/mL) MDA(nmol/mL)NC 8 191.19 ±13.81 10.25 ±3.78 M 8 155.78 ±16.42* 19.14 ±5.99*Met 8 183.40 ±12.56▲ 11.00 ±4.27▲DL 8 169.22 ±11.10 15.40 ±6.08 DH 8 183.73 ±12.32▲ 12.22 ±3.43▲

3.4 代平顆粒對2 型糖尿病大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下觀察正常對照組(圖A):胰島及胰腺腺泡結(jié)構(gòu)完整，胰島數(shù)目較多，胰島呈圓形，邊界清晰，胰島細(xì)胞排列規(guī)整，無腫脹、壞死，無炎性細(xì)胞浸潤;糖尿病模型組(圖B):胰島數(shù)目較少，胰島明顯萎縮，邊界模糊，胰島細(xì)胞排列紊亂，其數(shù)量較正常對照組明顯減少，可見細(xì)胞腫脹、偶有細(xì)胞壞死現(xiàn)象，細(xì)胞核可見染色不清或深染;二甲雙胍組(圖C):胰島邊界較清晰，細(xì)胞數(shù)量較模型組有所增加，核清晰，細(xì)胞形態(tài)較好，無明顯細(xì)胞腫脹、壞死;代平顆粒低劑量組(圖D):與模型組相近，胰島改善程度小，胰島數(shù)目較模型組數(shù)目有所增加，體積增大;代平顆粒高劑量組(圖E):胰島的結(jié)構(gòu)形態(tài)較模型組及低劑量組改善明顯，胰島邊界較清晰，細(xì)胞數(shù)量較模型組增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無明顯腫脹壞死，無核固縮現(xiàn)象，接近正常胰島結(jié)構(gòu)，而且對胰島的恢復(fù)比二甲雙胍顯著。

圖1 各組大鼠胰腺病理形態(tài)學(xué)變化(HE 染色×200)Fig.1 Pathological morphology changes of pancreas in each group(HE dyed×200)

4 討論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，陰虛為本，燥熱為標(biāo)為其基本病機(jī)，陰虛貫穿于糖尿病的始終，涉及肺、脾、腎、肝等臟腑，尤以腎陰虧虛最為重要?！短绞セ莘健访鞔_提出了“三消者，本起腎虛，或食肥美所發(fā)也”，黃坤載在《四圣心源·消渴》中云:“消渴者足厥陰之病也。厥陰風(fēng)木與少陽相火為表里，……凡木之性專欲疏泄，……疏泄不遂，則相火失其蟄藏”，《醫(yī)學(xué)三字經(jīng)·消渴》曰“一身中惟肝火最橫，燔灼無忌，耗傷津液，而為消渴”。說明消渴的發(fā)生與肝、腎密切相關(guān)，腎主水，司開合，為藏精之臟，腎陰虧虛則虛火內(nèi)灼;腎之開合功能，有賴于肝的疏泄;肝失疏泄，氣郁化火，必先損耗肝陰;肝腎同源，肝火亢盛，下劫腎陰，使腎之陰精耗損，津液不足，則多飲，下焦虛衰，腎氣攝納失職，約束無權(quán)，則多尿。故肝腎陰虛，陽熱偏亢是2 型糖尿病主要病機(jī)之一。

代平顆粒由制首烏、桑葉、銀耳、桑椹中藥組成，方中制首烏補(bǔ)肝腎，益精血，桑葉清肺潤燥，平抑肝陽，兩藥合用滋腎平肝為該方主藥，銀耳、桑椹潤肺，補(bǔ)腎，生津，全方共奏滋腎平肝，潤肺生津止渴功效?！侗静菰酚涊d何首烏“常食……可輕身”，說明何首烏能調(diào)節(jié)血脂。我國歷代有桑葉治消渴的記載，《本草綱目》曰“桑葉乃手足陽明之藥，煎汁代茗，能止消渴，名目長發(fā)”。唐·《新修本草》記載“桑椹味甘寒、無毒，單食主消渴”。相聰坤等［3］研究何首烏二苯乙烯苷類提取物能明顯降低血清TC，TG，LDL-C，MDA 含量，提高高脂血癥大鼠血清SOD活性。我們進(jìn)行單味藥篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)桑葉有較好的降低空腹血糖和餐后血糖的效果，從桑椹中提取桑椹多糖可以降低2 型糖尿病大鼠血糖，調(diào)節(jié)血脂［4］。施洪飛等［5］報(bào)道黑桑椹提取液使肝臟過氧化脂質(zhì)(LPO)明顯降低;全血谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)活性顯著提高(P ＜0.01)，認(rèn)為桑椹提取液具有一定的抗氧化作用。銀耳的藥理活性主要與銀耳多糖有關(guān)，前期研究［6］發(fā)現(xiàn)銀耳多糖具有明顯降低糖尿病大鼠血糖、血漿HbAIc 含量、增加胰島素分泌，改善胰島素抵抗的作用。綜上所述，該方中藥配伍不僅符合中醫(yī)立法原則，而且具有現(xiàn)代藥理學(xué)研究依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)糖尿病模型組大鼠具有2 型糖尿病大鼠的特征，不僅存在嚴(yán)重的糖脂代謝紊亂，表現(xiàn)為FBG，TC，TG 和LDL-C 水平升高，HDL-C 降低，而且存在氧化損傷，表現(xiàn)為血清MDA 顯著升高，SOD 活力明顯降低，并且有一定程度胰腺損傷。藥物干預(yù)后，代平顆粒低劑量組有降糖趨勢，高劑量組能顯著降低2 型糖尿病大鼠的FBG，降低TG，TC 和LDL-C水平，升高HDL-C，SOD 活力顯著升高，MDA 水平顯著下降，說明代平顆粒高劑量組能抑制2 型糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng);代平顆粒低劑量組胰島改善程度小，與糖尿病模型組相近，高劑量組胰島的結(jié)構(gòu)形態(tài)較模型組及低劑量組改善明顯，胰島邊界較清晰，細(xì)胞數(shù)量較糖尿病模型組增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，接近正常胰島結(jié)構(gòu)，而且對胰島的恢復(fù)比二甲雙胍組顯著。

本實(shí)驗(yàn)表明代平顆粒高劑量組有效改善2 型糖尿病大鼠糖-脂代謝，其機(jī)制可能與抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，修復(fù)鏈脲佐菌素所致的胰島細(xì)胞損傷有關(guān)。本組方為藥食同源中藥，降糖效應(yīng)比西藥組相對弱，但可以早期應(yīng)用和長期應(yīng)用。

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