張 智，李再新 ，趙志平，劉章琴，陳欲云

四川理工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，自貢643000

聚合物微球(Polymeric microspheres)系利用天然或合成的高分子材料(統(tǒng)稱為囊材)作為囊膜壁殼，將固體或液體藥物包囊成直徑為1～500 μm 的微小球體。微球技術(shù)將蛋白、多肽等類藥物制備成以微球?yàn)檩d體的長(zhǎng)效緩控釋制劑，通過皮下、肌肉或口服給藥，借助壓力、pH 值、酶解、溫度或提取等方法，使藥物在一定時(shí)間內(nèi)緩慢釋放出來，達(dá)到藥物長(zhǎng)效控釋作用［1］。在疫苗研制領(lǐng)域，微球是一種具有佐劑效應(yīng)的控釋系統(tǒng)，同時(shí)具備佐劑特征和控釋作用，已廣泛應(yīng)用于疫苗的傳送系統(tǒng)［2，3］。殼聚糖與海藻酸鈉均為優(yōu)良的天然高分子材料，具有無毒、生物相容性好、可生物降解、易成膜及成型等特點(diǎn)，常作為制備微球的良好材料。其中海藻酸鈉荷負(fù)電，殼聚糖荷正電，兩者可通過靜電相互作用形成微球，已經(jīng)廣泛用作于疫苗、藥物和生物制品等的載體［4，5］。將微球作為大腸桿菌疫苗的傳送載體，主要是利用微球的包封、緩釋和佐劑效果，延長(zhǎng)疫苗在體內(nèi)的作用時(shí)間，提高免疫的效果，同時(shí)還可以提高大腸桿菌疫苗在體外的穩(wěn)定性，防止外界環(huán)境對(duì)大腸桿菌的破壞作用。本文以殼聚糖和海藻酸鈉為材料，通過探索大腸桿菌微球的不同制備方法，期望制備的微球?qū)Υ竽c桿菌的穩(wěn)定性、包封率和緩釋作用達(dá)到最佳效果，為大腸桿菌疫苗的動(dòng)物免疫奠定基礎(chǔ)。

1 材料和儀器

1.1 試驗(yàn)菌種

大腸桿菌菌種(由本實(shí)驗(yàn)室選育)。

1.2 主要試劑

殼聚糖和海藻酸鈉均購自上海生工;無水氯化鈣(Cat.No.C3306，Sigma);碳酸鈣、液體石蠟、冰乙酸、醋酸鈉和菜籽油等化學(xué)試劑均購自成都科龍化工試劑廠，均為分析純。

1.3 主要儀器

SW-CJ-2F 型超凈工作臺(tái)，上海成順儀器儀表有限公司;HZ150L 型恒穩(wěn)培養(yǎng)振蕩器，武漢瑞華儀器有限責(zé)任公司;IJ-I 型精密增力電動(dòng)攪拌器和OHP-9160B 智能型電熱恒溫培養(yǎng)箱，均購自上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;H-1850R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Multiskan Mk3 酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific 公司;UPH-II-20T 優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司;101-3AB 恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司;H6500i熒光顯微鏡，重慶光電儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

取實(shí)驗(yàn)室凍存菌種接種于EMB 平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，在EMB 平板上挑選呈紫黑色帶金屬光澤的單菌落轉(zhuǎn)接種于LB 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，次日按1‰接菌，37 ℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(約3 h)。

2.2 涂板計(jì)數(shù)

采用倍比稀釋法逐步稀釋，從10-1逐步稀釋到10-10，并涂板。將培養(yǎng)皿倒置放入電熱恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)18～24 h 后，觀察大腸桿菌菌落數(shù)，即得菌懸液大腸桿菌的數(shù)量。

2.3 微球的制備

2.3.1 方法一

按Polk A 等［6］方法進(jìn)行大腸桿菌微囊制備，并略作改進(jìn)。取1.2 mL 海藻酸鈉溶液(25.0 g/L)加入到2.0 mL 大腸桿菌混懸液中，混勻并靜置20～30 min 使氣泡完全消失。在60 rpm 的機(jī)械攪拌情況下，用注射器將海藻酸鈉和大腸桿菌混合溶液緩慢滴加到50.0 mL 殼聚糖-氯化鈣混合溶液(0.1 M氯化鈣，0.6 mg/mL 殼聚糖，pH 4.5)中。微球?qū)⑺矔r(shí)成型，而后將其在室溫條件下放置8～10 h。隨后離心獲得微球并用去離子水洗2～3 次后，在室溫中干燥，并進(jìn)行目視檢查和拍照。

2.3.2 方法二

按Goosen MFA 等［7］方法進(jìn)行大腸桿菌微囊制備，并略作改進(jìn)。稱取3.0 g 海藻酸鈉，用超純水定容至100 mL 制成3.0%的海藻酸鈉溶液。稱取5.5 g 無水氯化鈣固體，用超純水定容至1 L 配制成0.05 M 的氯化鈣溶液。用海藻酸鈉溶液混懸培養(yǎng)好的大腸桿菌，然后將上述混合液按1∶5 的比例用注射器滴加至含0.2% Tween-80 的菜籽油中，并用精密增力電動(dòng)攪拌器以600 rpm 的速度攪拌10 min，制成W/O 型乳劑。然后再將0.05 M 氯化鈣溶液快速輕巧地沿?zé)诩又寥閯┲校?00 rpm 繼續(xù)攪拌，使破乳(所加氯化鈣溶液體積約為乳劑體積的4倍)的同時(shí)生成海藻酸鈣微球并沉淀析出。離心收集微球樣品，并用無菌水洗滌2～3 次，徹底除去菜籽油，無菌水重懸微球，并目視檢查和拍照。

2.3.3 方法三

采用乳化-內(nèi)部凝膠化法［8］制備大腸桿菌微球，并略作改進(jìn)。在2.0%海藻酸鈉溶液20.0 mL 中(注意:配置過程中稍加熱以使海藻酸鈉充分的溶解)加入碳酸鈣粉末1.5 g(注意:海藻酸鈉溶液趁熱時(shí)緩慢加入碳酸鈣粉末，以免成團(tuán))，用數(shù)顯恒溫電熱套磁力攪拌器攪勻后，再加入2 mL 大腸桿菌混懸液(緩慢成滴加入)，得均勻的O/W 型乳液。將乳液倒入含2.0%司班-80 的25 mL 液體石蠟中，用精密增力電動(dòng)攪拌器以200 rpm 的速度攪拌10 min，分散成均勻的O/W/O 型復(fù)乳。攪拌下將10.0 mL 液體石蠟(含冰醋酸1.2 mL)倒入復(fù)乳中，在酸性環(huán)境下分解出的Ca2+可引發(fā)凝膠化反應(yīng)使海藻酸鈉液滴固化形成大腸桿菌海藻酸鈣凝膠微球。靜置半小時(shí)后，用紗布過濾，將濾布上的沉淀加入1.0%吐溫-80 溶液25.0 mL(加吐溫時(shí)需加熱溶解才能達(dá)到去油的效果)，攪勻后再用紗布過濾，重復(fù)2 次，收集大腸桿菌海藻酸鈣凝膠微球。

配制含0.5%殼聚糖的50.0 mL 醋酸鈉-醋酸pH 4.5 緩沖液(醋酸鈉1.8 g，冰醋酸980.0 μL，純化水稀釋至100.0 mL，再加0.5 g 殼聚糖，攪拌至溶解，用紗布過濾除去少量的不溶物)，加入上述所得的大腸桿菌海藻酸鈣凝膠微球，反應(yīng)10 min，紗布過濾，置于10.0 mL 生理鹽水中終止反應(yīng)，再次用紗布過濾，收集沉淀即得微球，并目視檢查和拍照。

2.4 鏡檢微球形態(tài)大小

將消毒好的載玻片從酒精瓶?jī)?nèi)取出一片，用打火機(jī)點(diǎn)燃，去除酒精，待其載玻片冷卻后取一定量制備好的含菌微球在熒光顯微鏡下進(jìn)一步觀察。

2.5 微球包封率

本實(shí)驗(yàn)采用扣除法測(cè)微球的包封率，公式即為:

未被包封的大腸桿菌主要包括油相中未被包進(jìn)的大腸桿菌和在最終形成微球時(shí)混合液體中剩余的大腸桿菌。檢測(cè)油相中大腸桿菌的量時(shí)，取100.0 μL 放入EP 管逐步稀釋搖勻，再從各管中取出50.0 μL 涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿倒置放入電熱恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，16 h)培養(yǎng)并計(jì)數(shù)(混合液體中菌的檢測(cè)方法與檢測(cè)油相的相同)。

2.6 微球大腸桿菌的釋放

將2.0 g 大腸桿菌海藻酸鈣-殼聚糖微球放入10.0 mL 生理鹽水中，搖勻后再從中取出1.0 mL 置于10.0 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4，含0.5 %十二烷基硫酸鈉)中，在37 ℃、100 rpm 的條件下攪拌，每間隔一定時(shí)間取出100.0 μL PBS 釋放液。將取出的100.0 μL PBS 釋放液放入EP 管以10 倍的比例逐步稀釋，搖勻后，取出50.0 μL 涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿倒置放入電熱恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，16 h)培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，重復(fù)設(shè)置10 個(gè)平板。

2.7 微球的穩(wěn)定性

將大腸桿菌海藻酸鈣-殼聚糖微球置于4 ℃的環(huán)境中，每放置一段時(shí)間后，取出50.0 mg 置于1.0 mL PBS 緩沖液中，緩慢攪拌1 h。取50.0 μL 涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿倒置放入電熱恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，16 h)培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，重復(fù)設(shè)置10個(gè)平板。

2.8 數(shù)據(jù)處理

采用t-檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 微球的制備

方法一所得的顆粒雖較圓整，但粒徑較大(＞5 mm)，不利于注射(如圖1A)，達(dá)不到微球的標(biāo)準(zhǔn);方法二所得的顆粒有些不圓整，粒徑也較大(＞5 mm)，不利于注射用(如圖1B)，亦達(dá)不到微球的標(biāo)準(zhǔn);方法三采用乳化-內(nèi)部凝膠化法制備的顆粒細(xì)小，目視呈乳狀(如圖1C)。進(jìn)一步將方法三制備的顆粒進(jìn)行顯微鏡檢，如圖1D 可以看出此方法獲得的顆粒雖均勻性不夠，但比較圓整，粒徑較小，大多數(shù)微球的粒徑為50～180 μm 之間，其平均粒徑為100 μm，達(dá)到微球的要求。

圖1 不同制備方法制備的微球形態(tài)Fig.1 Images of microspheres made by three different methods

3.2 微球包封率

采用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)按上述方法三制得微球的制備過程中油相和水相大腸桿菌數(shù)，推測(cè)微球內(nèi)菌數(shù)，結(jié)果如(表1)所示，微球的包封率可以達(dá)到93.09%。

表1 包封率測(cè)定值(n=10，±s)Table 1 Amount of E.coli loaded on alginate-chitosan microspheres (n=10，±s)

表1 包封率測(cè)定值(n=10，±s)Table 1 Amount of E.coli loaded on alginate-chitosan microspheres (n=10，±s)

次數(shù)Times菌落總量Total E.coli(個(gè)/mL)油相中的量E.coli in oil phase水相中的量E.coli in water phase包封的量Loaded in microsphere包封率(%)Loading efficiency 5 4.60 ±0.32 × 1011 4.95 ±0.38 × 109 5.49 ±0.41 × 1010 4.30 ±0.22 × 1011 ≈93.09

3.3 微球大腸桿菌體外的釋放

包封大腸桿菌活菌的海藻酸鈣-殼聚糖微球在PBS 緩沖溶液中釋放大腸桿菌，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣品，涂布在LB 培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)。從圖2 可見在4～48 h 內(nèi)大腸桿菌釋放速度平緩，在48～80 h 期間大腸桿菌的釋放速度加快，最多可以達(dá)到3.20 ×108/mL。并且暗示微球有保護(hù)大腸桿菌的作用。

圖2 海藻酸鈣-殼聚糖微球不同時(shí)間釋放大腸桿菌情況(n=3，±s)Fig.2 E.coli released from calcium alginate-chitosan microspheres in different time (n=3，±s)

3.4 微球的穩(wěn)定性

按照方法三制備的大腸桿菌海藻酸鈣-殼聚糖微球放置在4 ℃冰箱中，8、16、32、64 d 取出，涂布培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落，從圖3 可知，每隔一定時(shí)間，儲(chǔ)存的微球中釋放出來大腸桿菌菌落數(shù)變化不顯著，暗示制得的微球在一定時(shí)間內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

3 討論

由殼聚糖、海藻酸鹽等制備的緩釋微球是近年來研究較為廣泛的生物微球體系，具有良好的生物相容性和生物可降解性等特點(diǎn)，是較為理想的藥物載體［4，9］。陳莉敏等［10］利用殼聚糖和海藻酸鈉通過復(fù)凝聚法將萘普生制成微球，得出在殼聚糖濃度∶海藻酸鈉濃度為1∶1，pH 值為4.0，攪拌速度為300 rpm，反應(yīng)溫度為35 ℃條件下，萘普生成球工藝達(dá)到最佳。但不同藥物分子大小和理化特征與微球壁材之間的相互作用有可能影響微球的載藥性能。大腸桿菌菌體大小在0.5～2.0 μm 之間，相對(duì)于其它抗原、蛋白多肽等分子個(gè)體較大，將滅活或減毒的菌體與殼聚糖等微球壁材制備成微球，其方法、工藝和微球性質(zhì)具有顯著的差異，但目前還未見這方面的研究報(bào)道。在本文，我們以天然高分子材料殼聚糖和海藻酸鹽為微球壁材，探索了大腸桿菌微球的制備方法及其微球性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用方法一和方法二制備的大腸桿菌微球體積過大，盡管我們?cè)噲D通過改進(jìn)緩慢滴加、高速攪拌等多種方式，但均不能改善成球過大缺點(diǎn)。在方法三中，我們采用乳化-內(nèi)部凝膠化法來制備大腸桿菌海藻酸鈣-殼聚糖微球，發(fā)現(xiàn)其制備的微球顆粒較小且粒性較好。進(jìn)一步考察其包封率，發(fā)現(xiàn)包封效果較好，表明大腸桿菌與海藻酸鈣-殼聚糖凝膠有較好的相容性。雖然海藻酸鈣-殼聚糖凝膠可能形成較大的空隙，但大腸桿菌胞體也較大，因此，在大腸桿菌釋放過程中隨著凝膠的溶解，大腸桿菌緩慢釋放，但前期釋放平緩，后期加速，這一特殊現(xiàn)象有待于進(jìn)一步研究。通過大腸桿菌海藻酸鈣-殼聚糖微球穩(wěn)定性的研究，發(fā)現(xiàn)在低溫條件下微球中的大腸桿菌穩(wěn)定存活，表明海藻酸鈣-殼聚糖微球?qū)Υ竽c桿菌的活性具有一定的保護(hù)作用。我們的這些研究結(jié)果為大腸桿菌微球疫苗的制備和動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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