張喜峰，李彩霞，張 瑾，張芬琴

河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，張掖734000

在葡萄酒加工過(guò)程中，每年產(chǎn)生約占葡萄加工量20%～30%的大量皮渣廢棄物，其中主要是葡萄皮、種子和果梗等。葡萄籽中含有原花青素、葡萄籽油、白藜蘆醇、維生素、單寧等多種功能性成分［1，2］。其中原花青素具有抗氧化，清除自由基，保護(hù)心血管，預(yù)防高血壓等多種藥理活性作用［3，4］。

目前原花青素的提取方法有微波萃取、超聲波提取、超臨界萃取法、膜分離技術(shù)、酶解法等［5-7］。雙水相萃取技術(shù)是基于液-液萃取理論，同時(shí)保持生物活性所開(kāi)發(fā)的一種新型萃取分離技術(shù)。具有分離條件溫和、操作簡(jiǎn)單、易連續(xù)操作、易保持分離物生物活性、易與其他技術(shù)集成等特點(diǎn)［8］。采用乙醇-硫酸銨雙水相體系與其他高聚物的雙水相萃取相比，具有價(jià)廉、低毒、分相清晰的特點(diǎn)，萃取相不含粘度大，難處理的聚合物，并能縮短提取時(shí)間，降低提取成本［9］。并通過(guò)超聲波法良好的提取作用與醇-鹽雙水相體系相結(jié)合，將提取分離一體化［10］。

本實(shí)驗(yàn)在建立乙醇-硫酸銨雙水相體系的基礎(chǔ)上，采用超聲波集成乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取分離葡萄籽中的原花青素，運(yùn)用Plackett-Burman(PB設(shè)計(jì))［11］、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及利用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法(Design-expert8.0.5.0 軟件)得到雙水相萃取原花青素最佳條件。為原花青素工業(yè)化制備和葡萄籽綜合利用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

取甘肅濱河食品工業(yè)集團(tuán)葡萄酒下腳料，經(jīng)挑選、清洗、曬干、粉碎，得到干凈的葡萄籽。

無(wú)水乙醇、香草醛、甲醇、濃鹽酸、硫酸銨均為分析純(天津市世化工有限公司)，兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品(上海友思生物技術(shù)有限公司)。

粉碎機(jī)(河北黃驊新興電器廠);722 型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);電子天平(PL203)(梅特勒-托利多上海儀器有限公司);FH3 型恒溫磁力加熱攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司);PHS-3C酸度計(jì)(北京哈納科技有限公司);SB120DT 超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系

乙醇-硫酸銨雙水相體系參照文獻(xiàn)［10］，在水溶性乙醇中加入硫酸銨，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系，通過(guò)改變乙醇與水的比例和鹽的用量可以控制雙水相體系的形成。

1.2.2 原花青素的超聲提取與雙水相分離

準(zhǔn)確稱取2 g 葡萄籽粉末，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入一定量的乙醇和水，浸泡一段時(shí)間后，再加入一定量的(NH4)2SO4成相，超聲提取一定時(shí)間，過(guò)濾，濾液于分液漏斗中靜置分層，分別測(cè)定上相乙醇相和下相清液中原花青素的含量。

1.2.3 香草醛-鹽酸法測(cè)定原花青素的含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［12］，選兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)，分別吸取不同濃度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，加4%香草醛甲醇溶液3 mL，再加入1.5 mL 濃鹽酸，避光反應(yīng)15 min。以0.5 mL 蒸餾水，4%香草醛甲醇溶液3 mL，1.5 mL 濃鹽酸為空白對(duì)照，避光反應(yīng)15 min。在500 nm 處測(cè)定吸光值。以反應(yīng)體系所測(cè)吸光值y 為縱坐標(biāo)，兒茶素含量(mg)為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y =6.0451X+0.0115，R2=0.9956。1.2.4 樣品中原花青素的分析

吸取4% 香草醛甲醇溶液3 mL，濃鹽酸1. 5 mL，加入萃取樣品液0.5 mL(若濃度較大，可以進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋)，避光反應(yīng)15 min，在500 nm 處測(cè)定吸光值。將吸光度代入回歸方程計(jì)算原花青素濃度，按下式計(jì)算出原花青素的提取率Y 和雙水相體系的分配系數(shù)K。

式中:原花青素提取物質(zhì)量是指雙水相體系中上相原花青素質(zhì)量(C上V上)。C上和C下是指雙水相體系中上相和下相原花青素的濃度。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 Plackett-Burman( PB) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)雙水相萃取所需要的條件，選擇了可能影響葡萄籽原花青素提取的6 個(gè)因素:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、超聲時(shí)間、pH;為對(duì)6 個(gè)因素全面考察，采用試驗(yàn)次數(shù)n =12 的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，設(shè)計(jì)情況見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)因素水平范圍Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)找出顯著因素后，安排最陡爬坡試驗(yàn)，要先逼近最佳區(qū)域后再建立有效地響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡法試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，能快速，經(jīng)濟(jì)地逼近最佳區(qū)域?？梢粤私鈱?shí)驗(yàn)因素隨試驗(yàn)指標(biāo)影響的規(guī)律性，即每個(gè)因素的水平改變時(shí)，指標(biāo)是怎樣變化的，找出響應(yīng)面因素水平的中心點(diǎn)。

1.3.3 Box-Benhnken Design( BBD) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得出的顯著因素的較優(yōu)作為中心點(diǎn)，每個(gè)因素在中心點(diǎn)上下適當(dāng)范圍內(nèi)再取兩個(gè)水平組合為在最大響應(yīng)區(qū)研究提取原花青素的關(guān)鍵因素，依據(jù)Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 法篩選影響原花青素提取的主要因素

按照6 因素、n =12 次的Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行12 次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，效應(yīng)評(píng)價(jià)

見(jiàn)表3。一般認(rèn)為影響值比較大的因素對(duì)系統(tǒng)的貢獻(xiàn)較大，從表3 可以看出，所考察的六個(gè)因素對(duì)原花青素提取率的影響順序依次為X2＞X5＞X1＞X4＞X6＞X3，即硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞超聲溫度＞pH ＞料液比，其中X3、X4、X6(料液比，超聲溫度，pH)對(duì)結(jié)果的影響不大，而X2(硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù))的影響最為顯著。所以，通過(guò)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果可以看出，X2(硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù))、X5(超聲時(shí)間)、X1(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù))這三個(gè)因素為顯著因素，下一步對(duì)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)這三個(gè)因素進(jìn)行最優(yōu)化的考察，而對(duì)X3(料液比)、X4(超聲溫度)、X6(pH)三個(gè)因素不做太多考慮，根據(jù)表3 的結(jié)果，正效應(yīng)選高水平，負(fù)效應(yīng)選低水平。下一步通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)逼近提取條件的最佳區(qū)域。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=12)Table 2 Plackett-Burman design matrix and corresponding results (n=12)

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平及其效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 3 Levels and effects of six factors after Plackett-Burman design optimization

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面因素水平的中心點(diǎn)

因?yàn)轫憫?yīng)面二次擬合方程在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，所以應(yīng)先使得顯著因素的水平盡量逼近最佳提取條件，再建立有效的擬合方程，最陡爬坡試驗(yàn)正好滿足這一需求。

根據(jù)Plackett-Burman 主效應(yīng)分析，在最陡爬坡試驗(yàn)中對(duì)A(乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù))、B(硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù))、C(超聲時(shí)間)3 因素的變化方向，步長(zhǎng)作了相應(yīng)的設(shè)計(jì)，具體取值和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。從表4 數(shù)據(jù)可知，原花青素萃取率隨關(guān)鍵因素的改變而變化，萃取率最高的為第6 組，說(shuō)明該組實(shí)驗(yàn)的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比接近最優(yōu)。故選第6 組為中心水平進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。

2.3 Box-Benhnken 設(shè)計(jì)顯著因素的最優(yōu)水平

依據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果確定因素與水平，利用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)對(duì)試驗(yàn)提取條件進(jìn)行了3因素3 水平的響應(yīng)面分析優(yōu)化，各因素和水平見(jiàn)表5。運(yùn)用Design-expert8.0.5.0軟件進(jìn)行Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)情況及結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of steepest ascent test

表5 Box-Benhnken 試驗(yàn)因素及水平Table 5 Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

表6 Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 The experimental design and results for response surface analysis

12 0 1 1 8.6 23 13 0 0 0 11.1 30.1 14 0 0 0 11 29.1 15 0 0 0 11.3 29.7 16 0 0 0 10.9 29.4 17 0 0 0 10 28.9

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

運(yùn)用Design-expert 軟件進(jìn)行二次回歸擬合后，得到以下回歸方程:Y =29.54-0.9625A-0.4875B +0. 6C-0. 025AB + 0. 05AC + 0. 2BC-4. 9825A2-3.0825B2-3.1575C2

p-Prob ＞F 值小于0.05，則表明該模型或考察的因素有顯著影響，p-Prob ＞F 值小于0.01 則表明影響極為顯著。由方差分析表7 可知，模型p-Prob＞F 值小于0.0001，則說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選模型極為顯著。模型失擬項(xiàng)(lack of fit)的p-Prob ＞F 值為0.1141，大于0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型選擇比較合理。乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)A(p-Prob ＞F =0.0108)，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)二次項(xiàng)A2(p-Prob ＞F ＜0.0001)，硫酸銨量分?jǐn)?shù)二次項(xiàng)B2(p-值Prob ＞F ＜0.0001)，超聲時(shí)間二次項(xiàng)C2(p-值Prob ＞F ＜0.0001)，這說(shuō)明這些因素對(duì)模型顯著，該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況較好。模型決定系數(shù)R2為98.04%，表明這3 個(gè)因素對(duì)原花青素提取率的影響占98.04%，而其他因素的影響和誤差占1.96%，該模型的相關(guān)度很好，與實(shí)際情況擬合良好，此模型可以用于原花青素提取條件的分析和預(yù)測(cè)。

表7 Box-Benhnken Design 回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance of the fitted regression model

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與顯著因素最佳值的確定

采用Design-expert8.0.5.0 軟件繪制了因素之間的等高線圖。從圖1 中可以看出，圖中等高線均呈圓形，則表明AB、AC、BC 交互作用不顯著。

通過(guò)圖1 中的等高線圖可以看出，當(dāng)各因素從四周逐漸趨向于中心點(diǎn)時(shí)，等高線圖中提取率逐漸增加，則說(shuō)明各因素的值越靠近中心點(diǎn)時(shí)，葡萄籽原花青素的提取率越大，響應(yīng)值存在最大值，進(jìn)而說(shuō)明最陡爬坡試驗(yàn)的中心點(diǎn)取值較合理，回歸模型顯著。通過(guò)Design-expert 軟件分析計(jì)算得出，當(dāng)預(yù)測(cè)的響應(yīng)值最大時(shí)，三個(gè)因素的最佳值為:A-乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.45%，B-硫酸銨質(zhì)量數(shù)23. 46%，C-超聲時(shí)間45.46 min，預(yù)測(cè)提取率最大值為29.6%。

圖1 因素之間的等高線圖Fig.1 Different effects of Contour

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證建立的模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否相符，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果確定的最佳條件進(jìn)行了3 組驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的平均提取率為30.1%，這與預(yù)測(cè)值29.6%相接近，證明擬合模型能較好的反映原花青素的最佳提取條件。并且與優(yōu)化前(優(yōu)化前條件:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%、硫酸銨質(zhì)量數(shù)20%、超聲時(shí)間20 min)提取率相比提高了6 倍。

優(yōu)化后葡萄籽原花青素的最佳提取條件為:A-乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.45%，B-硫酸銨質(zhì)量數(shù)23.46%，C-超聲時(shí)間45.46 min。此時(shí)，提取率為30.1%，分配系數(shù)為11.5。

2.3.4 雙水相體系總質(zhì)量為1000 g 的放大實(shí)驗(yàn)

在2 L 燒杯中加入214.5 g 無(wú)水乙醇，234.6 g硫酸銨，1∶7 料液比加入葡萄籽粉末，加水至1000 g，50 ℃溫度下超聲提取45.46 min，分液漏斗分相，取上相，經(jīng)過(guò)三次平行放大實(shí)驗(yàn)原花青素提取率為30.23%。

3 結(jié)論

利用Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行原花青素提取條件的優(yōu)化，證實(shí)乙醇

質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)原花青素提取率有顯著影響。優(yōu)化后葡萄籽原花青素的最佳提取條件為:按乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.45%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)23.46%配制雙水相，料液比1∶7，50 ℃溫度下超聲提取45. 46 min，原花青素的提取率可達(dá)30.23%，分配系數(shù)為11.5。

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