榮 輝，林祥志 ，王龍梅，蘇永全

1廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院;2國家海洋局第三海洋研究所，廈門361005

非蛋白質(zhì)氨基酸是指除組成蛋白質(zhì)的20 種常見氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物。非蛋白質(zhì)氨基酸多為蛋白氨基酸的類似物或取代衍生物，如甲基化、磷酸化、羥化、糖苷化、交聯(lián)等等。除此之外，還包括β、γ、δ 氨基酸及D-氨基酸［1］。非蛋白質(zhì)氨基酸多以游離或小肽的形式存在于生物的各種細(xì)胞或組織中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)分離得到的非蛋白質(zhì)氨基酸已達(dá)700 余種，其中已測(cè)定分子結(jié)構(gòu)的有400 多種，在植物中發(fā)現(xiàn)的約240種，動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的有50 多種，其余多存在于微生物中［2］。非蛋白質(zhì)氨基酸可以作為合成其它含氮物質(zhì)的前身，如激素、抗生素、生物堿、色素等，還可作為組成細(xì)菌細(xì)胞壁的成分。非蛋白質(zhì)氨基酸還可參與儲(chǔ)能，充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)，參與跨膜離子通道的形成，并在抗癌、抗菌、抗結(jié)核、護(hù)肝、降血壓、升血壓等方面都發(fā)揮了極其重要的作用［3］。

銅藻Sargassum horneri (Turn.)C. Ag. 屬于馬尾藻屬，是非食用海藻，主要分布于我國東海、南海沿岸，資源相當(dāng)豐富，常用作飼料、藻膠、飲料的原料，部分地區(qū)作為中藥海藻使用。目前已從馬尾藻中發(fā)現(xiàn)多類具有生物活性的化合物，主要有甾類化合物、萜烯類化合物、甘油糖脂、間苯三酚衍生物及其聚合物等物質(zhì)，銅藻的化學(xué)成分研究較少，僅報(bào)道含褐藻酸、甘露醇、多糖、甾醇等［4］。本論文主要開展了銅藻中游離非蛋白質(zhì)氨基酸的檢測(cè)分析、部分分離及結(jié)構(gòu)鑒定研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銅藻Sargassum horneri (Turn.)C.Ag.:采自中國福建沿海，由汕頭大學(xué)丁蘭平教授鑒定，保存在國家海洋局第三海洋研究所藻類種質(zhì)資源庫內(nèi)。

1.2 試劑及儀器

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)，PITC(異硫氰酸苯酯，Sigma)，乙腈、正己烷、甲醇等均為色譜純，HCl(優(yōu)級(jí)純)，其他試劑均為分析純。

主要儀器:高效液相色譜儀(日本島津，LC-20A)，半制備高效液相色譜儀(日本島津，LC-8A)，核磁共振儀(美國Bruker，Metcurty-400)，紅外光譜儀(美國Bruker，VERTEX 70)，高分辨質(zhì)譜儀(美國Waters，LCT Premier XE)。

1.3 銅藻游離氨基酸的分離

取一定量粉碎的銅藻藻粉用75%的乙醇(料液比為1∶5)浸泡24 h，然后40 ℃超聲提取30 min，共三次。旋蒸濃縮至無乙醇(40 ℃下)，將水相用乙酸乙酯(水相∶乙酸乙酯為1∶1～5)萃取三次，留水相。將水相濃縮至一定體積，過陽離子交換樹脂，接3 mol/L 氨水洗脫液，濃縮至干，用0.1 mol/L 的HCl定容，待檢測(cè)分析。

1.4 PITC-HPLC 柱前衍生反相高效液相色譜法檢測(cè)［5］

1.4.1 色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-SP C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);柱溫38 ℃;SPD-M20A 檢測(cè)器，檢測(cè)波長254 nm;進(jìn)樣量10 μL 。流動(dòng)相A:0.1 mol/L 醋酸鈉(用冰乙酸調(diào)pH 為6.5)-乙腈(體積比為97∶3)的溶液;流動(dòng)相B:乙腈-水(體積比為4∶1)的溶液。線性洗脫程序:0.0 min，0%B;13 min，7%B;23 min，23%B;29 min，35%B;35 min，40%B;40 min，100%B;45 min，100%B;47 min，0%B。流速為1.0 mL/min。

A 的配制:3 g 醋酸鈉溶解在370 mL 水中，用冰乙酸調(diào)pH 至6.5，加入28 mL 乙腈，用0.45 μm 的濾膜過濾。

1.4.2 對(duì)照品混合溶液和樣品的衍生

取對(duì)照品混合溶液或樣品200 μL 置于離心管中，加入0. 1 mol/L PITC -乙腈溶液100 μL，1. 0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液100 μL，混勻，室溫下放置1 h 后加入400 μL 正己烷，漩渦混合器振蕩1 min，靜置10 min。用移液器吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。

PITC-乙腈溶液:36 μL PITC 和2.164 mL 乙腈混合。

三乙胺-乙腈溶液:417 μL 三乙胺和2.583 mL乙腈混合。

1.5 未知組分的制備分離

為確定檢測(cè)到的未知組分的結(jié)構(gòu)，采用半制備型高效液相色譜儀對(duì)衍生后的游離氨基酸粗提物進(jìn)行制備分離。收集到的目標(biāo)產(chǎn)物濃縮后經(jīng)不加醋酸鈉的流動(dòng)相再次分離除去鹽后經(jīng)旋蒸除去有機(jī)溶劑，再進(jìn)行冷凍干燥，收集樣品待結(jié)構(gòu)鑒定。

色譜柱:Shim-Pack PRC-ODS(20 × 250 cm);SPD-20A 檢測(cè)器，檢測(cè)波長254 nm;進(jìn)樣量5 mL。流動(dòng)相A:0.1 mol/L 醋酸鈉(用冰乙酸調(diào)pH 值為6.5)-乙腈(97∶3，v/v)的溶液;流動(dòng)相B:乙腈-水(4∶1，v/v)的溶液。線性洗脫程序:0.0 min，0%B;13 min，7% B;23 min，23% B;29 min，35% B;35 min，40%B;40 min，100%B;45 min，100%B;47 min，0%B。流速為18 mL/min。

1.6 未知組分的結(jié)構(gòu)鑒定

將制備分離到的高純化合物樣品分別進(jìn)行核磁共振波譜(400 M)、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜分析以確定其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅藻游離氨基酸的分離

銅藻粉末先經(jīng)乙醇超聲提取，再經(jīng)乙酸乙酯萃取，最后經(jīng)陽離子交換樹脂層析除去大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖等，所收集的3 mol/L 氨水組分經(jīng)茚三酮乙醇溶液顯色反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，其含有高濃度的氨基酸組分，隨后并進(jìn)行了PITC-HPLC 法檢測(cè)分析。此分離方法運(yùn)用有機(jī)溶劑和超生萃取相結(jié)合的方式，減少了提取時(shí)間，且增加了提取效果。

2.2 PITC-HPLC 法檢測(cè)分析

2.2.1 線性關(guān)系分析

分別取100，50，25，10，5 μL 的對(duì)照品混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其按照上述方法進(jìn)行衍生，以各種氨基酸峰面積Y 為縱坐標(biāo)，氨基酸實(shí)際摩爾濃度X 為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明17 種氨基酸在0.078～1.25 mol/L 與峰面積比具有良好的線性關(guān)系。氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖和得到的每種氨基酸的線性回歸方程分別見圖1 和表1。

圖1 17 種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard samples by PITC-HPLC

表1 17 種氨基酸的線性回歸方程Table 1 The linear regression equations of 17 kinds of amino acids

2.2.2 方法的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液200 μL 按照上述方法衍生后連續(xù)進(jìn)樣5 次，以色譜峰峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察其精密度，17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度試驗(yàn)RSD在0.20%2.49% (n =5)，均在允許范圍內(nèi);取對(duì)照品溶液200 μL 按照上述方法衍生后分別在0、4、8、12、24、48、56 h 進(jìn)樣，以色譜峰峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察其穩(wěn)定性，17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD 在0.28%～1.31%(n =7)，均在允許范圍內(nèi);取同一批銅藻樣品5 份，按上述方法提取、衍生、測(cè)定，以色譜峰峰面積為指標(biāo)分別計(jì)算RSD，考察方法的重復(fù)性，銅藻所含各種氨基酸峰面積的RSD 在0.70%～2.23%，同樣均在允許范圍內(nèi)。

2.2.3 回收率試驗(yàn)

吸取已知含量的銅藻樣品100 μL，準(zhǔn)確加入氨基酸混標(biāo)100 μL，按照上述方法分別衍生、進(jìn)樣，外標(biāo)法定量，如此平行5 次，計(jì)算各氨基酸的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，平均回收率在78.50%～101.82%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.51%～3.45%，均在允許范圍內(nèi)。

2.2.4 PITC-HPLC 檢測(cè)結(jié)果

通過與17 種混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖比較分析發(fā)現(xiàn)銅藻樣品中除了蛋氨酸、胱氨酸外包含15 種其他常見蛋白質(zhì)氨基酸及3 種未知組分，且含量較高的常見蛋白質(zhì)氨基酸為丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸。3種未知組分的衍生物分別為MWZ1(6. 3 min)、MWZ2(12.9 min)、MWZ3(26.6 min)，見圖2。

圖2 銅藻樣品液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of Sargassum horneri (Turn..)Ag. sample by PITC-HPLC

2.3 制備分離

由于3 種未知組分衍生物中MWZ1、MWZ3 的含量過低而未進(jìn)行制備分離，最終采用半制備高效液相色譜系統(tǒng)制備分離到1 種未知衍生組分MWZ2，其制備分離HPLC 色譜圖分別如圖3，MWZ2 的出峰時(shí)間為10.6 min。收集未知組分經(jīng)無鹽流動(dòng)相除鹽后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，再經(jīng)真空冷凍干燥后MWZ2 為略黃固體粉末。

圖3 MWZ2(10.6 min)的HPLC 制備分離圖Fig.3 Separation of MWZ2(10.6 min)by PITC-HPLC

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

分離獲得的MWZ2 是衍生劑異硫氰酸苯酯(PITC)與銅藻樣品某一組分通過衍生反應(yīng)生成的衍生物，其反應(yīng)方程式如下。

MWZ2 為黃色固體粉末，IR (KBr)υ (cm-1):3436 (NH2)，3292 (COOH)，1564，1413，805 (Ph)，1022 (C = S);TOF-MS-ESI m/z(%):226.2804［M+H］+;1H-NMR (400 MHz，MeOD)δ:7.48～6.96(m，5H)，4.91 (m，1H)，2.94 (m，2H);13C NMR(100 MHz，MeOD)δ:176.0，130.4，129.6，126.5，125.1，57.8，39.2。結(jié)合核磁共振波譜、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜數(shù)據(jù)，最終推測(cè)MWZ 去掉已知取代基團(tuán)PITC 后的成分為β-丙氨酸，它的分子式為C3H7NO2，分子量為89.09，其分子結(jié)構(gòu)式如圖4。

圖4 β-丙氨酸Fig.4 β-Alanine

3 討論

目前，用于氨基酸分離純化的方法有沉淀法、膜分離法、萃取法以及離子交換法等，其中以離子交換法應(yīng)用最為廣泛。該法根據(jù)氨基酸是兩性電解質(zhì)這一特性，以及目的氨基酸與雜質(zhì)氨基酸pK、pI 值的差異，利用離子交換樹脂對(duì)各種氨基酸吸附能力的不同進(jìn)行分離純化［6］。本實(shí)驗(yàn)采用Dowex 50W-X8型陽離子交換樹脂對(duì)銅藻游離氨基酸粗提樣品進(jìn)行分離，收集高濃度氨水洗脫液，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分離效果較好，含有多種氨基酸組分。

近些年來，隨著氨基酸的廣泛應(yīng)用，用液相色譜法檢測(cè)氨基酸的分析水平也不斷提高，柱前衍生是先將氨基酸轉(zhuǎn)化成衍生物，再進(jìn)行色譜分離的一種衍生方法，操作簡(jiǎn)便、快速，靈敏度高，并在短時(shí)間內(nèi)能分離20 多種氨基酸，針對(duì)各種衍生劑的研究與開發(fā)，目前應(yīng)用廣泛的方法有異硫氰酸苯酯(PITC)法，鄰苯二甲醛-巰基乙醇(OPA)法，6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)法等［7］。PITCHPLC 法與其它柱前衍生法相比，其衍生過程簡(jiǎn)便，衍生物齊全，而衍生物的高靈敏度、高穩(wěn)定性，使各種氨基酸含量的檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，不失為一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的方法［8］，可廣泛應(yīng)用于海洋藻類中非蛋白質(zhì)氨基酸的檢測(cè)分析研究。但由于本實(shí)驗(yàn)所用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)僅為17 種常見蛋白氨基酸混合品，缺乏20 種常見氨基酸中的天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸，并不能判定另外兩種未知組分就一定是非蛋白質(zhì)氨基酸，另還需考慮寡肽等的可能性，具體需進(jìn)一步分離純化來確定，但因含量過低而未進(jìn)行。

本研究從銅藻中發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸組分并鑒定了其結(jié)構(gòu)，它是自然界中唯一存在的β 型氨基酸［9］，其氨基位于碳鏈的β 位，與它常見的類似物左旋α-丙氨酸不同，它沒有手性中心。β-丙氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，在生物體內(nèi)，β-丙氨酸并不參與蛋白質(zhì)或酶的合成，通常它由二氫尿嘧啶和肌肽的降解產(chǎn)生。β-丙氨酸也是自發(fā)生成的縮氨酸肌肽和維生素B5 的重要組分，在正常狀態(tài)下，β-丙氨酸被最終代謝為乙酸。β-丙氨酸是肌肽少有的幾個(gè)前體物質(zhì)之一。已經(jīng)證實(shí)，補(bǔ)充β-丙氨酸有助于提升肌肉組織內(nèi)肌肽的含量，從而消除運(yùn)動(dòng)員疲勞，提升肌肉活動(dòng)能力，但如果β-丙氨酸攝入量(以溶液或膠囊服用)超過10 mg 每千克體重，將誘發(fā)機(jī)體感覺異常［10］。銅藻資源豐富，我們的研究為更好的利用此藻提供了新的方向。

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