郭曉強(qiáng)，何 鋼，劉 嵬，楊軼浠，劉 波，茍小軍*

1成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院;2 成都大學(xué)藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610106

銀耳(Tremella fuciformis Berk)又稱白木銀耳、雪耳等，我國銀耳產(chǎn)區(qū)主要集中在四川通江和福建漳州等地，銀耳具有“補(bǔ)腎、潤肺、生津、止咳”之功效。隨著銀耳功能性組分的明確以及銀耳多糖(Tremella polysaccharides，TP)藥理活性的研究深入，銀耳所含有的酸性多糖具有廣泛的生理活性，能提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、清除自由基，誘導(dǎo)人體產(chǎn)生抗體及干擾素，可治療高血壓、高血脂、糖尿病等多種醫(yī)學(xué)中疑難病癥［1，2］。

在天然多糖分子中引入某種離子基團(tuán)并且具有恰當(dāng)?shù)娜〈葧r，不僅能夠顯著改善多糖在水溶液中的溶解度，而且可以使多糖在水溶液中的鏈構(gòu)象發(fā)生改變，從而使其具有某種特定的結(jié)構(gòu)而提高生物活性。［3］多糖的硫酸酯化可導(dǎo)致原有多糖的生物活性發(fā)生明顯改變，多糖的硫酸酯化成為多糖結(jié)構(gòu)修飾的一個重要方向。［4］本文從銀耳子實(shí)體中提取、分離純化得到銀耳多糖，采用氯磺酸-吡啶法研究在不同反應(yīng)條件下對硫酸酯化銀耳多糖(Sulfate Tremella polysaccharides，S-TP)取代度的影響，并且對不同取代度硫酸酯化銀耳多糖在體外清除羥基自由基的情況進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

銀耳子實(shí)體干品(市售)，氫氧化鈉、硫酸亞鐵、氯化鋇、水楊酸、硫酸鉀、明膠、氯磺酸、吡啶、氯仿、正丁醇、乙醇(95%)、三氯乙酸、H2O2(30%)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、濃鹽酸(均為國產(chǎn)分析純，新購置。)，透析袋(MW 8000，美國聯(lián)合碳化)，1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)購于百靈威科技公司。其中氯磺酸、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)按照要求進(jìn)行精制和干燥處理。［5］

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

GL-21M 型高速冷凍離心機(jī)(湘儀)、UV-1800紫外分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)、FD-1C-55型真空冷凍干機(jī)機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、UV-2802PC 紫外掃描儀(尤尼柯儀器有限公司)、Spectrum TWO 紅外光譜儀(Perkin Elmer 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銀耳多糖(TP)的制備［6］

銀耳子實(shí)體于70 ℃干燥2 h，粉碎，過60 目篩。取銀耳粉末50 g ，室溫條件下用乙醇(80%)攪拌浸泡銀耳粉末12 h，減壓抽濾，濾餅用10 倍體積70 ℃的水浸提5 h，冷凍離心，取上清液，并重復(fù)浸提1次。合并提取液，減壓濃縮，向殘余物中加入乙醇至終濃度80%，靜置2 h，離心分離，沉淀加適量蒸餾水溶解，取上清液，采用Sevage 試劑除蛋白后，80%乙醇析出沉淀經(jīng)過真空冷凍干燥即得銀耳多糖(TP)4.58 g，提取率為9.17%。

1.3.2 硫酸酯化銀耳多糖(S-TP)的制備［7，8］

1.3.2.1 磺?；噭┑闹苽?/p>

將8 mL 吡啶加入附有冷凝管和磁力攪拌裝置的50 mL 干燥三頸瓶中，冰鹽浴冷卻和攪拌條件下，用恒壓滴液漏斗慢慢加入氯磺酸2 mL，控制滴加速度，使溫度保持在室溫以下，反應(yīng)產(chǎn)物為淡黃色固體，備用。

1.3.2.2 硫酸酯化銀耳多糖(S-TP)的制備

室溫下銀耳多糖(TP)0.1 g 混懸于10 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌30 min 后將其加入制備好的磺?；噭┲校驮〖訜釘嚢? h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用2.5 mol/L 的NaOH 溶液中和反應(yīng)液至中性，攪拌下加入3 倍體積乙醇(95%)，析出沉淀，室溫攪拌過夜后離心收集沉淀，沉淀溶于適量蒸餾水中，用蒸餾水透析3 d，減壓濃縮，真空冷凍干燥獲得硫酸酯化銀耳多糖。

1.3.3 硫酸酯化銀耳多糖硫酸根離子含量的測定［9，10］

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取105 ℃干燥至恒重的硫酸鉀0.2175 g，以1 mol/L 鹽酸定容至50 mL 得到硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液，再配制3% 三氯乙酸溶液和BaCl2-明膠溶液(BaCl21.0%，明膠0.5%)，按表-1 實(shí)驗(yàn)條件加入具塞試管，室溫靜置15 min 后在360 nm 處測定其吸光值A(chǔ)1;再以相同體積的0. 5% 明膠溶液代替BaCl2-明膠溶液按照上述操作方法在360 nm 處測定其吸光度A2，以(A1-A2)對硫酸根濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 SO含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)條件Table 1 The experiment conditions of the standard curve of assaying SO

表1 SO含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)條件Table 1 The experiment conditions of the standard curve of assaying SO

濃度梯度Concentration gradient空白組Control 1 2 3 4 5 K2SO4(mL)Potassium sulfate 0.080.160.240.320.4 HCl(mL)Hydrochloric acid0.40.320.240.160.080三氯乙酸(mL)Trichloroacetic acid7.67.67.67.67.67.6 BaCl2-明膠(mL)(A1)Barium chloride -gelatin222222明膠(mL)(A2)Gelatin 0 2 2 2 2 2 2

1.3.3.2 試樣中硫酸根含量的測定

精確稱取硫酸酯化銀耳多糖試樣20 mg 于安瓿瓶中，加入2 mL 1 mol/L HCl 溶液，N2保護(hù)下封管。沸水浴加熱1 h，取0.2 mL 進(jìn)行試樣溶液進(jìn)行分析，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定其吸光度A1。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣中SO2-4的百分含量，再按照以下公式計算硫酸酯化銀耳多糖(S-TP)的取代度(DS)。［11］

DS=1.62 ×S% /(32-1.02 ×S%)

S%:試樣中硫元素百分含量。

1.3.4 紫外光譜分析

將硫酸酯化銀耳多糖溶液在200～400 nm 處掃描。

1.3.5 紅外光譜分析

銀耳多糖及硫酸酯化銀耳多糖用溴化鉀壓片后進(jìn)行紅外光譜測定。

1.3.6 清除羥基自由基的測定［12，13］

向試管中加入不同濃度多糖溶液1.00 mL，F(xiàn)e-SO4(1. 8 mmol/L)溶液2 mL，水楊酸-乙醇(1. 8 mmol/L)溶液1.50 mL，最后加H2O2(0.3%)0.10 mL 啟動反應(yīng)，振蕩混合，37 ℃水浴保溫30 min，在波長510 nm 處測定其吸光度值。并按下列公式計算多糖對羥基自由基的清除率。

清除率=［(A0-AS)/A0］×100%

A0:空白管的吸光度;AS:加入自由基清除劑后的吸光度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 硫酸酯化銀耳多糖紫外光譜測定結(jié)果

硫酸酯化銀耳多糖紫外掃描結(jié)果見圖-1，在260 nm 附近出現(xiàn)一個新的吸收峰，說明銀耳多糖分子可能連接上了硫酸酯基團(tuán)。［14］

圖1 硫酸酯化銀耳多糖UV 圖譜Fig.1The ultraviolet spectrogram of the sulfated Tremella polysaccharides

2.2 硫酸酯化銀耳多糖紅外光譜測定結(jié)果

銀耳多糖的紅外光譜見圖2，3424 cm-1處的寬吸收峰在3600～3200 cm-1之間，表示有O-H 的伸縮振動;在3000～2800 cm-1之間，2929 cm-1處弱吸收表示C-H 的特征峰;1626 cm-1處是C =O 鍵的吸收峰，1413 cm-1處是C-H 鍵的變角振動，以上各峰均為多糖的特征吸收峰。而1074 cm-1處的強(qiáng)吸收峰是吡喃糖環(huán)的醚鍵C-O-C 的吸收峰，897 cm-1處的弱吸收表明有β-D-葡聚糖的存在。

硫酸酯化銀耳多糖紅外光譜(圖3)中均保留了銀耳多糖的特征吸收峰，而新出現(xiàn)的1259 cm-1左右的S=O 伸縮振動和816 cm-1左右的C-O-S 伸縮振動的特征吸收峰，說明硫酸基以酯鍵的形式已經(jīng)連接在銀耳多糖分子上。

2.3 銀耳多糖硫酸酯化反應(yīng)條件的確定

根據(jù)表-2 中不同反應(yīng)條件按1.3.2 方法對銀耳多糖進(jìn)行硫酸酯化修飾，BaCl2-明膠比濁法測定硫酸根離子含量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖-4)，線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y =1.4804X-0.13(R2=0.9993)。

圖4 硫酸酯化銀耳多糖硫酸根離子含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of assaying SOfor the sulfated Tremella polysaccharides

在反應(yīng)溫度60 ℃下吡啶與氯磺酸按照4∶1、2∶1 和1∶1 三種體積比例制備硫酸酯化銀耳多糖(STP)，取代度測定結(jié)果及分析見表-2、圖-5。在相同反應(yīng)溫度下硫酸酯化銀耳多糖的取代度隨吡啶和氯磺酸比例的降低而減小，當(dāng)吡啶與氯磺酸比例(體積)為4∶1，60 ℃反應(yīng)3 h 時，DS 最大為1.32。

表2 硫酸酯化銀耳多糖硫元素含量(S%)和取代度(DS)測定結(jié)果Table 2 The reaction conditions，sulfur content(S%)and degree of substitution(DS)of the sulfated Tremella polysaccharides

圖5 硫酸酯化銀耳多糖不同反應(yīng)條件下取代度(DS)結(jié)果分析Fig.5 Assay of degree of substitution(DS)of synthetized sulfated Tremella polysaccharides under different reaction condition

2.4 S-TP 及TP 對Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基的清除作用

硫酸酯化銀耳多糖試樣(S-TP-1～ S-TP-3)和銀耳多糖(TP)均取20 mg，分別溶于10 mL 蒸餾水中配制成2 mg/mL 試樣溶液，對每個試樣分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水補(bǔ)足至1.0 mL。然后按照1.3.4 進(jìn)行反應(yīng)，測定試樣在A510處的吸光值，計算試樣對羥基自由基的清除率，結(jié)果見表-3 和圖-6。

硫酸酯化銀耳多糖(S-TP-1～ S-TP-3)和銀耳多糖(TP)對羥基自由基的清除能力基本隨試樣濃度的升高呈量效關(guān)系，其中S-TP-2 的0.8 mg/mL 實(shí)驗(yàn)組除外;當(dāng)S-TP 試樣濃度為0.8～2.0 mg/mL時，清除率均隨取代度增大而提高;高取代度試樣S-TP-1 濃度1.2～2.0 mg/mL 時清除率增加趨勢明顯減緩，而S-TP-2 和S-TP-3 在整個實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)清除率增大趨勢相對平緩，其中S-TP-2 的0. 8 mg/mL 實(shí)驗(yàn)組還較0.4 mg/mL 實(shí)驗(yàn)組清除率低。

當(dāng)試樣濃度0.8～2.0 mg/mL 時高取代度試樣S-TP-1 相對于對照組TP 的清除率具有明顯的優(yōu)勢，但隨濃度升高兩者之間的差距逐漸縮小;當(dāng)試樣濃度0.8～2.0 mg/mL 時對照組TP 對羥基自由基清除率均大于S-TP-3，試樣濃度1.2～2.0 mg/mL時對照組TP 對羥基自由基清除率優(yōu)于S-TP-2。

表3 S-TP-1～S-TP-3 及TP 對羥基自由基的清除率.Table 3 Scavenging effect on hydroxyl radical in vitro by different concentrations of TP and sulfated derivatives

圖6 S-TP 及TP 對羥基自由基的清除作用Fig.6 Assay of scavenging effect on hydroxyl radical in vitro by different concentrations of TP and sulfated derivatives

3 結(jié)論

氯磺酸-吡啶法制備硫酸酯化銀耳多糖在本實(shí)驗(yàn)條件下最佳反應(yīng)條件為吡啶與氯磺酸體積比4∶1，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時間3 h;硫酸酯化銀耳多糖硫元素含量S% =14.23%、取代度DS =1.32。在相同反應(yīng)溫度下硫酸酯化銀耳多糖的取代度隨吡啶和氯磺酸體積比的降低而減小，吡啶一方面作為氯磺酸與多糖發(fā)生酯化反應(yīng)生成氯化氫的縛酸劑，另一方面吡啶通過與氯磺酸反應(yīng)生成氯磺酸吡啶鹽而起到催化作用。［15］因此在氯磺酸和吡啶對銀耳多糖大大過量(本文氯磺酸為多糖的20 倍量)的情況下，吡啶與氯磺酸的體積比增加有利于硫酸酯化反應(yīng)的進(jìn)行。

硫酸酯化銀耳多糖對Fenton 反應(yīng)所產(chǎn)生羥基自由基均有一定的清除作用，且隨多糖濃度的增加，清除率升高，呈一定的量效關(guān)系。取代度為1.32 的S-TP 在0.8～2.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)相對于對照組TP 的清除率具有明顯的優(yōu)勢。多糖分子通過硫酸酯化引入硫酸根，引起極性增加、水溶性提高和粘度降低等理化性質(zhì)變化，取代度較高的銀耳多糖分子來說上述特性相對增加較多，這可能是導(dǎo)致硫酸酯化銀耳多糖隨取代度升高而體外活性提高的原因之一。［16］因此硫酸酯化修飾多糖分子可以作為天然產(chǎn)物改性的一個重要方法，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

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