崔晉龍，付少彬，王夢(mèng)亮*

1山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，太原030006;2 遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遵義563003

紅景天苷(Salidroside)是紅景天植物主要的活性成分之一，具有良好的抗氧化、抗輻射、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性［1］，是20 世紀(jì)60 年代逐步被重視的新型適應(yīng)原性植物藥［2］。近年來(lái)，人們將紅景天苷應(yīng)用于癌癥［3］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］、細(xì)胞衰老［5］、腦與心臟等器官缺氧與缺血［6］、認(rèn)知障礙［7］、皮膚斑［8］、代謝調(diào)節(jié)［9］等多方面的治療，拓展了其使用范圍，使得紅景天苷在化妝品、食品、保健品、藥品等工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用，導(dǎo)致市場(chǎng)供應(yīng)緊張，急需加快紅景天苷合成方面的研究。

從國(guó)內(nèi)外報(bào)道看，紅景天苷的來(lái)源主要包括生物合成(植物栽培、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)等)、化學(xué)合成、生物催化(酶催化)合成等三個(gè)方面，近幾年，相關(guān)理論和實(shí)踐都取得了重要進(jìn)步，對(duì)開(kāi)發(fā)高效、污染小的合成方法，緩解市場(chǎng)供應(yīng)緊張，保護(hù)紅景天物種等方面都具有重要意義。

1 生物合成來(lái)源的研究現(xiàn)狀

紅景天苷作為紅景天植物的次生代謝產(chǎn)物，含量介于0.10%～1.70%之間。為了提高植物含量，人們主要對(duì)其生物合成途徑、關(guān)鍵酶及基因、栽培條件等進(jìn)行了研究。

1.1 生物合成途徑及關(guān)鍵酶基因的研究

合成途徑和關(guān)鍵酶的研究是基礎(chǔ)理論問(wèn)題。紅景天苷在植物體內(nèi)是以酪醇和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)為底物，由糖苷酶催化合成的。其中的關(guān)鍵問(wèn)題之一是酪醇的合成，酪醇屬于酚類化合物，在植物體中，它通過(guò)莽草酸途徑合成［10］。在紅景天植物中，對(duì)莽草酸合成酪醇已進(jìn)行了深入的證明和探討(見(jiàn)圖1)，人們根據(jù)化合物的變化規(guī)律及相關(guān)代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的研究，生物合成機(jī)理獲得了很多證據(jù)。Ma 等對(duì)高山紅景天植物內(nèi)源性苯丙氨酸解氨酶基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，使p-香豆素大量積累，但結(jié)果表明酪醇不能大量合成［11］。Zhang 等對(duì)酪氨酸脫羧酶過(guò)量表達(dá)，結(jié)果表明酪醇和紅景天苷含量提高達(dá)274%和412%，說(shuō)明酪氨酸脫羧酶(RsTyrDC)能夠調(diào)控酪醇及紅景天苷的合成［12］。以上研究表明，酪醇源于酪氨酸，否定了源于苯丙氨酸代謝途徑的可能［13］。而高小東通過(guò)對(duì)高山紅景天苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化，證實(shí)了酪醇來(lái)源于苯丙氨酸的可能性［14］。Keski-Saaris 和Hu 分別證明2-氨基茚滿-2-磷酸(2-Aminoindan-2-phosphonic acid，AIP)的存在能夠抑制苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL)的活性，而后者是苯丙素苷類代謝途徑中的主要酶，結(jié)果導(dǎo)致酚類化合物、苯乙醇苷類物質(zhì)的濃度降低，紅景天苷積累嚴(yán)重受挫［15，16］。這證明了代謝途徑的正確性及PAL 的重要性。因此，張祖榮認(rèn)為，酪醇在生物體內(nèi)的合成具有多種可能性，它是隨著植物種類及組織、不同環(huán)境及時(shí)空條件下出現(xiàn)不同的表達(dá)差異［17］。

圖1 紅景天苷生物合成的可能途徑Fig.1 The possible biosynthetic pathway for salidroside

由酪醇合成紅景天苷，主要是UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucosyltransferase，UDPGT，UGTS)和β-D-葡萄糖苷水解酶(UDP-glycosidase hydrolysis enzyme，UDPGH)二種酶起作用。Ma 等通過(guò)分子克隆法，過(guò)量表達(dá)UGTS，紅景天苷的合成率得到明顯提高［18］。Yu 等采用基因工程的方法對(duì)高山紅景天的二個(gè)UGTS 基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明，含UGT72B14和UGT74R1 基因表達(dá)的細(xì)胞能夠得到高于對(duì)照420%和50%的紅景天苷，前者主要在根中大量表達(dá)，后者主要在愈傷組織細(xì)胞中大量表達(dá)，相比于后者，前者在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出很高的活性［19］。這些研究表明，在不同組織、不同時(shí)空條件下，UDTS和UDPGH 都可表現(xiàn)出不同的催化能力，同一種酶在不同組織中具有表達(dá)的多基因性。

1.2 生物合成提高產(chǎn)量的實(shí)踐現(xiàn)狀

以生物合成途徑和關(guān)鍵酶催化理論為基礎(chǔ)，學(xué)者通過(guò)對(duì)植物的栽培與組織培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)等多種方式進(jìn)行了提高紅景天苷產(chǎn)量的研究。在研究手段上主要采用了改變環(huán)境條件、飼喂代謝中間物、生物誘導(dǎo)等。Gy?rgy 等證實(shí)通過(guò)在培養(yǎng)基中增加葡萄糖、蔗糖等物質(zhì)，可以增加大花紅景天組織培養(yǎng)中糖苷類物質(zhì)的含量［20］;Weglarz 等綜合介紹了影響紅景天苷積累的內(nèi)外部因素，認(rèn)為紅景天苷含量與植物年齡無(wú)相關(guān)性、高海拔植物的紅景天苷含量高于低海拔、紅景天苷積累的最適溫度是20℃，而50～60 ℃會(huì)使其含量降低等［21］。Zhou 等采用轉(zhuǎn)基因高山紅景天毛狀根為材料，添加酪醇，酪氨酸和苯丙氨酸三種前體物質(zhì)、黑曲霉(Aspergillus niger)，彩絨革蓋菌(Coriolus versicolor)，紫靈芝(Ganoderma lucidum)三種誘導(dǎo)子來(lái)增加紅景天苷的積累，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化條件下的前體和誘導(dǎo)子濃度分別是1 mmol/L 和0.05 mg/L［22］。李熙英等采用4 種叢枝菌根菌與1 年生高山紅景天共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)摩西球囊霉(Glomus mosscac)和根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices)對(duì)紅景天生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用［23］?？傊?，通過(guò)轉(zhuǎn)基因、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)等手段進(jìn)行紅景天苷的生物合成，仍然是重要的研究方向。

2 化學(xué)方法的合成

化學(xué)方法成本低、速度快，是工業(yè)化生產(chǎn)紅景天苷的良好方向。主要理論依據(jù)是Koenigs-Knorr法［24］，這種方法是以酪醇類似物為底物，以重金屬鹽為主要催化劑進(jìn)行糖苷化反應(yīng)。它起始于1969年，但主要對(duì)近幾年的研究情況進(jìn)行總結(jié)。從文獻(xiàn)報(bào)道看，近幾年國(guó)外報(bào)道很少，表1 是我國(guó)學(xué)者進(jìn)行化學(xué)合成的基本情況表。

3 生物催化(酶)法合成紅景天苷

此法是基于酶催化理論，以酪醇和葡萄糖類似物為底物，采用生物酶或全細(xì)胞(微生物個(gè)體或細(xì)胞)催化合成紅景天苷的方法。其基本原理見(jiàn)圖2。

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圖2 D-葡萄糖與酪醇合成紅景天苷的反應(yīng)Fig.2 Glycosidase-catalysed synthesis of salidroside from Dglucose and tyrosol

3.1 糖苷酶催化理論

生物體內(nèi)糖苷化合物多是由糖苷轉(zhuǎn)移酶催化合成，它能特異性的催化糖基從活性中間體(如UDP 衍生物)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)產(chǎn)物分子上。糖基轉(zhuǎn)移酶只負(fù)責(zé)糖基的轉(zhuǎn)移，不會(huì)導(dǎo)致底物和產(chǎn)物水解。按照糖基化反應(yīng)中底物及產(chǎn)物立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，糖基轉(zhuǎn)移酶分為保持型和翻轉(zhuǎn)型。保持型糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)，需要完成兩步取代反應(yīng)，第一步是產(chǎn)生糖基-酶中間復(fù)合物，接著受體再完成第二步取代反應(yīng)。翻轉(zhuǎn)型酶催化的反應(yīng)要通過(guò)一個(gè)氧絡(luò)正碳離子-離子樣的過(guò)渡狀態(tài)，受體對(duì)供體C1進(jìn)行親核攻擊完成簡(jiǎn)單取代反應(yīng)，見(jiàn)圖3-A［31］。部分學(xué)者認(rèn)為［18］，紅景天苷以尿苷二磷酸葡萄糖為葡萄糖基供體，以酪醇為受體分子催化合成紅景天苷。

也有學(xué)者認(rèn)為，β-D-葡萄糖苷酶是紅景天苷合成的關(guān)鍵酶。糖苷水解酶類具有水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶雙重活性［32］，水解酶活性使紅景天苷分解為酪醇和葡萄糖，轉(zhuǎn)移酶活性使得糖基結(jié)合到苷元上去。毛多斌認(rèn)為［33］，糖苷酶發(fā)揮逆水解反應(yīng)活性，是以葡萄糖為親核底物(糖、醇)，直接縮合成紅景天苷，并產(chǎn)生水，見(jiàn)圖3-B。以供糖基物質(zhì)和親核物質(zhì)(糖、醇)為底物時(shí)，酶催化糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)(圖3-C)是糖苷酶把糖基供體上的糖基轉(zhuǎn)移到受體親核物質(zhì)上的過(guò)程，大多數(shù)糖苷酶都催化這種反應(yīng)。在轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)過(guò)程中，糖基供體在轉(zhuǎn)化的同時(shí)會(huì)發(fā)生水解，糖苷生成(b 途徑)的同時(shí)也會(huì)發(fā)生水解(a 途徑)。這兩種活性在不同生物體及不同的時(shí)空條件下表現(xiàn)出不同的能力。在紅景天苷合成中，是其中一種還是兩種活性都發(fā)揮作用?還是在不同反應(yīng)條件下，活性表現(xiàn)的強(qiáng)弱不同，現(xiàn)在尚不清楚［34］。

3.2 生物催化合成紅景天苷的研究現(xiàn)狀

近年來(lái)，人們主要從天然植物種子材料、真菌中提取酶或?qū)⑷?xì)胞用于催化合成試驗(yàn)，手段上采用了固體或液體發(fā)酵、工業(yè)反應(yīng)轉(zhuǎn)化等。Zhang 等從大量培養(yǎng)A.niger 中提取并純化酶，催化1.5%的酪醇和6%的葡萄糖合成產(chǎn)率為10%的紅景天苷［35］。賈艷萍等從犁頭霉屬(Absidia sp.)中提取粗酶液，得到了用酪醇和葡萄糖催化合成紅景天苷的優(yōu)化條件［36］。Yu 等用戊二醛交聯(lián)蘋果籽粉做成多孔網(wǎng)狀固定化酶，以叔丁醇為介質(zhì)，采用高效、環(huán)境友好的方法催化合成紅景天苷，產(chǎn)率為1.9 g/L·d，產(chǎn)品純度達(dá)99.3%［37］。高雪華采用固體和液體發(fā)酵法從A.niger H35 和H42 中提取合成紅景天苷的合成酶系，通過(guò)酶促反應(yīng)使紅景天苷的含量提高了194.2%，并獲得高產(chǎn)的最適反應(yīng)條件［38］。Kurashima 等從杏仁粗粉中提取β-葡萄糖苷酶，以叔丁醇-水混合溶液為反應(yīng)介質(zhì)，合成了一系列紅景天苷類似物，產(chǎn)率在11%～22%之間［39］。宋偉舟采用上述二株菌進(jìn)行雙株協(xié)調(diào)發(fā)酵，在最佳條件下，紅景天苷產(chǎn)量能提高86. 28%，總有效成分含量提高94.68%，證明雙株優(yōu)于單株菌的轉(zhuǎn)化效果［40］。王夢(mèng)亮課題組在多方面進(jìn)行了生物催化合成紅景天苷的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以微生物全細(xì)胞、β-葡萄糖苷酶都能催化合成紅景天苷，非水相、離子液體等介質(zhì)中有利于發(fā)揮酶活性，將酶固定化后能夠達(dá)到提高產(chǎn)量的目的［41-44］。總之，近幾年，采用生物催化方法合成紅景天苷已經(jīng)成為科研工作者重視的研究方向。

圖3 生物催化合成紅景天苷的關(guān)鍵酶催化機(jī)理Fig.3 Catalytic mechanism of key enzymes in biocatalytic synthesis of salidroside

4 展望

全球紅景天植物共92 種，我國(guó)分布72 種，是主要的分布和生產(chǎn)國(guó)，也是我國(guó)藏族人民使用一千多年的傳統(tǒng)藥物，稱為“高原人參”［45］。其主要活性成分紅景天苷所擁有的良好適應(yīng)原藥性，受到高山作業(yè)、深海作業(yè)、運(yùn)動(dòng)員等特殊行業(yè)人員的青睞。近幾年，隨著科學(xué)不斷發(fā)展，人們以紅景天苷生物代謝途徑和關(guān)鍵酶理論為基礎(chǔ)，結(jié)合化學(xué)催化理論，進(jìn)行了多方面的合成研究。三大類提高紅景天苷產(chǎn)量的合成方法各具優(yōu)缺點(diǎn)。生物合成是最基礎(chǔ)的方法，對(duì)研究代謝途徑、闡明合成關(guān)鍵酶等理論至關(guān)重要，但是，紅景天苷作為植物次生代謝產(chǎn)物，提高幅度有限，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，土地浪費(fèi)嚴(yán)重;化學(xué)合成法具有快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但需要多步的保護(hù)與去保護(hù)步驟，其中的重金屬催化劑具有污染環(huán)境、威脅健康等缺點(diǎn);生物催化法是有前途的方法，具有反應(yīng)條件溫和、高效、污染小等優(yōu)點(diǎn)，但目前仍沒(méi)有獲得廉價(jià)、穩(wěn)定、高效的實(shí)用酶，還需要極其昂貴的UDPG 作為輔助底物，使成本過(guò)高［32］。

關(guān)于紅景天苷的高效合成仍需進(jìn)行理論和實(shí)踐的進(jìn)一步深入研究，開(kāi)展代謝途徑與關(guān)鍵酶的功能與調(diào)控、酶催化機(jī)理等多方面的廣泛與精細(xì)化研究，結(jié)合化學(xué)材料、代謝組學(xué)、工程學(xué)等領(lǐng)域新出現(xiàn)的方法技術(shù)，實(shí)現(xiàn)這一天然產(chǎn)物的高效合成，具有重要意義。

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