謝勤嵐，于小卉

(中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074)

血液對人體的作用不言而喻，它將氧氣從肺部運(yùn)輸?shù)缴眢w的各個(gè)組織，并將身體組織產(chǎn)生的二氧化碳運(yùn)走；它將消化系統(tǒng)產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)缴眢w的各個(gè)細(xì)胞，并帶走腎臟產(chǎn)生的排泄物.血液幫助我們的身體對抗各種感染和毒素，并通過其凝血功能止血，保持人體溫度的平衡.醫(yī)務(wù)人員通常通過血液來檢測和診斷疾病.在血液細(xì)胞圖像檢測中，通常為了減少噪聲而要先做圖像增強(qiáng)，然后檢測血液細(xì)胞圖像特征，尤其是細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì).在采用數(shù)字圖像處理技術(shù)對細(xì)胞圖像中的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，由于細(xì)胞圖像中經(jīng)常有細(xì)胞粘連甚至部分重疊現(xiàn)象，使得統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)目產(chǎn)生較大的誤差.

為了解決細(xì)胞圖像識別與統(tǒng)計(jì)的問題，不少研究者做了很多工作.劉莉莉和王錚[1]提出了一種適合血細(xì)胞圖像的改進(jìn)流域分割算法，能使血細(xì)胞區(qū)域有效分割出來，解決了目標(biāo)粘連現(xiàn)象.Karunakar和Kuwadekar[2]采用標(biāo)記控制的分水嶺算法，設(shè)計(jì)出用于血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的Android手機(jī)程序.Kimbahune和 Uke[3]提出了一種脈沖耦合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法來處理血細(xì)胞圖像，并證實(shí)其方法和結(jié)果真實(shí)可靠.林小竹等人[4]針對在圖像分析中所獲得的目標(biāo)相互粘連，提出了一種有效的分水嶺分割算法，可以解決目標(biāo)物體粘連和計(jì)數(shù)問題.周浩等人[5]運(yùn)用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)對血細(xì)胞圖像進(jìn)行邊緣提取，結(jié)果表明基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的邊緣提取算法對于細(xì)胞血液邊緣提取有很好的效果.陳立英等人[6]提出了一種基于最大類間方差法的遺傳分割算法，用于血液細(xì)胞圖像分割，結(jié)果表明該算法具有快速穩(wěn)定的特點(diǎn).趙超陽等人[7]利用Matlab圖像處理工具箱對視錐細(xì)胞進(jìn)行圖像處理，分析了細(xì)胞密度分布特點(diǎn).

本文基于Matlab語言，通過程序?qū)崿F(xiàn)了一種簡便的血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的工程方法.該方法可以進(jìn)行有效地血紅細(xì)胞識別，并能對血紅細(xì)胞進(jìn)行較為準(zhǔn)確的數(shù)目統(tǒng)計(jì).

1 血紅細(xì)胞圖像預(yù)處理

為了得到準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，在計(jì)數(shù)前需要對細(xì)胞圖片進(jìn)行預(yù)處理.對血紅細(xì)胞圖像進(jìn)行灰度化、二值化、中值濾波、邏輯運(yùn)算、形態(tài)學(xué)處理，以滿足后續(xù)標(biāo)記、去粘連和計(jì)數(shù)的需要.

1.1 灰度化

國際照明委員會(CIE)選擇的色彩三基色是紅色(R)、綠色(G)和藍(lán)色(B)，三基色按照一定比例混合就可以得到自然界中幾乎所有色彩.考慮到血紅細(xì)胞圖像顏色單調(diào)，轉(zhuǎn)化成灰度圖像仍能保留完整的信息，而且從空間和速度方面考慮，將彩色圖片轉(zhuǎn)化成灰度圖像，不僅可以減少運(yùn)算量，提高數(shù)據(jù)處理速度，還可以將減少圖像存儲空間.圖片的灰度化就是將彩色圖片中的色度和飽和度刪除，僅保留其亮度信息.彩色圖像進(jìn)行灰度化有4中常用方法：三色均值法、最大分量法、加權(quán)平均法、轉(zhuǎn)化到其他顏色空間方法.

本文采用加權(quán)平均法來進(jìn)行灰度化，應(yīng)該根據(jù)圖像包含的信息或?qū)D像信息提取的要求，賦予R、G、B不同的權(quán)值.權(quán)重可以根據(jù)R、G、B三色分布直方圖獲得三個(gè)分量的取值范圍.本文的灰度化處理公式如下：

(1)

1.2 二值化和中值濾波

由于灰度圖片中還存在背景和噪聲，要想直接從圖片中獲取細(xì)胞圖像，將灰度圖像進(jìn)行二值化.二值化處理中需要設(shè)定一個(gè)灰度閾值t，將灰度大于閾值的設(shè)置為1，小于閾值的設(shè)置為0，如式(2)所示.

(2)

從式(2)可以看出，灰度閾值t對二值化處理結(jié)果影響很大，目前存在很多方法用來優(yōu)化閾值t的選擇，比如Ostu法[8]、一維交叉熵值法[9]等.

為了消除二值圖像中的噪聲，中值濾波可以在不減少圖像對比度的情況，在一定程度上有效消除脈沖噪聲且不會模糊邊界.它的原理是將數(shù)字圖像中一點(diǎn)的值用該點(diǎn)臨域的各點(diǎn)值的中值代替，讓周圍的像素值更接近真實(shí)值，從而消除孤立的噪聲點(diǎn).濾波結(jié)果如圖1(b)所示，對比圖1(a)，可以發(fā)現(xiàn)通過對中值濾波后，細(xì)胞邊緣擴(kuò)大，特別是圖片邊界的細(xì)胞.細(xì)胞邊緣擴(kuò)大，黑色增多(二值圖像"0"增多).

圖1 自動閾值二值化圖像和中值濾波后的二值化圖像

1.3 邏輯運(yùn)算

通過初次二值化圖像與中值濾波后的二值化圖像進(jìn)行“或”運(yùn)算將優(yōu)化圖像效果，然后將圖像取反，使原本圖片中黑色的細(xì)胞變白，并將細(xì)胞中心黑色的部分填充，便于細(xì)胞計(jì)數(shù).從圖2(c)可以看出，填充背景的圖像中，消除了一些由于取反帶來的噪聲，更接近真實(shí)情況.

圖2 邏輯運(yùn)算后的二值化圖像、取反后的圖像和填充背景后的圖像

1.4 形態(tài)學(xué)處理

由于圖片中細(xì)胞粘連程度不相同，運(yùn)用“開運(yùn)算”使圖像的邊緣細(xì)胞得到較好的分離.圖像開運(yùn)算也即先進(jìn)行腐蝕運(yùn)算后膨脹運(yùn)算，可以表示為：

A°B=(QΘB)⊕B.

(3)

開運(yùn)算的結(jié)果是使圖像邊界平滑，去除圖像中不包含結(jié)構(gòu)信息的對象區(qū)域，斷開窄小的鏈接，而保留圖像中的包含結(jié)構(gòu)元素的對象區(qū)域，并且保持其形狀和大小均不變.由于腐蝕是去除了較小的亮細(xì)節(jié)，而隨后的膨脹中又沒有恢復(fù)，所以在實(shí)際應(yīng)用中，灰度圖的開運(yùn)算常用于去除相對于結(jié)構(gòu)元素而言較小的亮點(diǎn)，同時(shí)保留所有的灰度和較大的亮區(qū)特征不變.

圖3 開運(yùn)算后的圖像

2 細(xì)胞計(jì)數(shù)

進(jìn)行開運(yùn)算后，對圖像進(jìn)行細(xì)胞邊界識別，便于后續(xù)細(xì)胞統(tǒng)計(jì).本文采用8連通來識別，即向當(dāng)前像素點(diǎn)的8個(gè)方向：0°、45°、90°、135°、180°、225°、270°、315°，分別進(jìn)行識別.具體識別算法如下.

(1) 首先按照從上往下，從左到右的順序掃描圖像，尋找沒有標(biāo)記跟蹤結(jié)束記號的第一個(gè)邊界起始點(diǎn)P0.P0是具有最小行和列值的邊界點(diǎn).定義一個(gè)掃描方向變量dir，該變量用于記錄上一步中沿著前一個(gè)邊界點(diǎn)到當(dāng)前邊界點(diǎn)的移動方向，其初始化取值為7.

(2) 按逆時(shí)針方向搜索當(dāng)前像素的3×3鄰域，其起始搜索方向設(shè)定為：當(dāng)dir是奇數(shù)時(shí)，起始搜索方向?yàn)?dir+7)mod 8(對8取模)；當(dāng)dir是偶數(shù)時(shí)，起始搜索方向是 (dir+6)mod 8.在3×3鄰域中搜索到的第一個(gè)與當(dāng)前像素值相同的像素即為新的邊界點(diǎn)Pn，同時(shí)更新變量dir為新的方向值.

(3) 如果Pn等于第二個(gè)邊界點(diǎn)P1且前一個(gè)邊界點(diǎn)Pn-1等于第一個(gè)邊界點(diǎn)P0，則搜索停止，結(jié)束跟蹤，否則重復(fù)步驟2繼續(xù)搜索.

(4) 由邊界點(diǎn)P0，P1，P2，…，Pn-2構(gòu)成的邊界即為要識別的細(xì)胞邊界.

細(xì)胞邊界識別結(jié)果如圖4所示.對細(xì)胞邊界進(jìn)行識別之后，采用“貼標(biāo)簽”算法，將背景元素設(shè)置為0，將第一個(gè)連通區(qū)域標(biāo)記為1，第二個(gè)連通區(qū)域標(biāo)記為2，以此類推.標(biāo)記結(jié)束后最大的連通區(qū)域即為初步的連通域數(shù)目，存入數(shù)組Number.分析連通域數(shù)目，統(tǒng)計(jì)標(biāo)簽數(shù)組中相同標(biāo)簽的個(gè)數(shù)，存入數(shù)組Sum.存入數(shù)組Sum的元素，對應(yīng)的是連通區(qū)域的大小，也即細(xì)胞的面積大小.結(jié)合實(shí)際細(xì)胞面積，剔除非細(xì)胞區(qū)域的連通域，得到初步的細(xì)胞數(shù)目，存入數(shù)組Number.計(jì)算細(xì)胞區(qū)域的加權(quán)平均面積，作為細(xì)胞面積閾值A(chǔ)rea_TH.判斷Sum元素與細(xì)胞面積閾值的大小關(guān)系，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞粘連情況，計(jì)算出連通域分割數(shù)目N，準(zhǔn)確計(jì)算出細(xì)胞數(shù)目為Number+N.詳細(xì)的計(jì)算流程如圖5所示.

圖4 細(xì)胞邊界識別

圖5 細(xì)胞計(jì)數(shù)流程圖

3 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

本文以人體血液涂片為研究對象，采用奧林巴斯CX31顯微鏡觀察血液細(xì)胞圖像，并采用RZ F300C工業(yè)相機(jī)垂直拍攝圖像.由于相機(jī)拍攝的圖像超出了顯微鏡視野范圍，導(dǎo)致拍攝到的血液紅細(xì)胞圖像中間亮，邊緣暗.截取了原圖像和顯微鏡視野范圍一致的部位進(jìn)行圖像處理和計(jì)數(shù).

為了驗(yàn)證本文的方法，對采集的血紅細(xì)胞圖像進(jìn)行處理后，采用ImageJ軟件幫助人工計(jì)數(shù)，并與本文方法計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行對比.ImageJ是一款基于Java的公共圖像處理的開放軟件，能對圖片進(jìn)行圖像操作、對圖像的區(qū)域和像素進(jìn)行統(tǒng)計(jì).ImageJ的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6所示.兩種方法的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示.從表1可以看出，本文方法可以很好地統(tǒng)計(jì)血紅細(xì)胞的數(shù)目，與人工計(jì)數(shù)相比，圖6(a)的誤差是2.67％，圖6(b)的計(jì)數(shù)誤差是0.37％.另外，采用分水嶺算法對相同的血紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖7所示，計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示.從表1中可以看出，本文方法比分水嶺算法的計(jì)數(shù)結(jié)果更為準(zhǔn)確.

圖6 ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖7 采用分水嶺算法得到的a)和b)細(xì)胞圖像結(jié)果

表1 三種不同方法統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)目結(jié)果對比

4 結(jié)語

本文基于Matlab語言，提出了一種用于血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的工程方法.該方法可以對血紅細(xì)胞圖像進(jìn)行灰度化、二值化、邏輯運(yùn)算、形態(tài)學(xué)處理、細(xì)胞邊緣識別，并用于細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì).經(jīng)與ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果相比，本文方法的統(tǒng)計(jì)結(jié)果誤差在5％以內(nèi)，比分水嶺算法的計(jì)數(shù)結(jié)果更加準(zhǔn)確.結(jié)果表明，本文方法簡便可行，是一種有效的工程圖像處理方法.

[1] 劉莉莉,王 錚.一種適合血細(xì)胞圖像分割的改進(jìn)流域分割算法[J].微電子學(xué)與計(jì)算機(jī),2010，27(11)：37-39.

[2] Karunakar Yogesh,Kuwadekar Alhad. An unparagoned application for red blood cell counting using marker controlled watershed algorithm for Android mobile[C]//IEEE. Fifth International Conference on Next Generation Mobile Application,Services and Technologies.Beijing:IEEE,2011: 100-104.

[3] Kimbahune Vinod V，Uke Nelesh J. Blood cell image segmentation and counting [J]. International Journal of Engineering Science and Technology,2011,3(3): 2448-2453.

[4] 林小竹,王彥敏,杜天蒼,等.基于分水嶺變換的目標(biāo)頭像的分割與計(jì)數(shù)方法[J].計(jì)算機(jī)工程,2006,32(15),181-183.

[5] 周 浩,李天牧,尉 洪. 基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的血液細(xì)胞圖像邊緣提取[J]. 北京生物醫(yī)學(xué)工程,2002,21(2): 89-92.

[6] 陳立英,裴喜春,侯振杰. 基于遺傳算法的血液細(xì)胞圖像的分割方法研究[J]. 計(jì)算技術(shù)與自動化,2008,27(2)：89-92.

[7] 趙超陽,姚軍平,劉 勇,等. 基于Matlab視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞的圖像處理[J]. 中國組織工程研究，2013,17(15)：2780-2785.

[8] Nobuyuki Ostu. A threshold selection method from gray-level histogram[J]. IEEE Transactions on Systems,Man,and Cybernetics,1979,9(1): 62-66.

[9] Li C H,Lee C K. Minimum cross entropy thresholding[J]. Pattern Recognition,1993,26(4): 617-625.