祝雪蘭, 許樹成

(1.阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院; 2.阜陽市紅旗中學(xué)，阜陽 236041)

細(xì)胞內(nèi)Ca2+，H+與活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 是植物體內(nèi)廣泛存在的響應(yīng)生物或非生物脅迫、調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的因子。人們越來越傾向認(rèn)為，這些調(diào)節(jié)因子所顯示的時(shí)空動(dòng)態(tài)復(fù)雜變化模式是它們信號(hào)行為的一部分。因此，檢測Ca2+，H+與ROS的動(dòng)態(tài)變化，是研究和了解這些細(xì)胞因子對(duì)植物起調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵。然而，上述無機(jī)信號(hào)分子在細(xì)胞內(nèi)濃度等時(shí)空變化的有效檢測或監(jiān)測手段一直較少。目前這些信號(hào)的顯像技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，并且可以在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上對(duì)上述信號(hào)(分子)進(jìn)行原位實(shí)時(shí)定量鑒定[1]。 這些顯像或成像方法是基于一些小分子染料可以與Ca2+，H+和ROS發(fā)生專一性的相互作用、從而使染料熒光特性發(fā)生改變的原理。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，使用綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)，可以在亞細(xì)胞尺度上，對(duì)Ca2+，H+和ROS信號(hào)分子進(jìn)行高分辨定位分析。

1 Ca2+在植物活細(xì)胞體內(nèi)的成像

1.1 細(xì)胞內(nèi)Ca2+成像分子探針

Ca2+被認(rèn)為是廣泛存在的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)子，因此人們十分關(guān)注這種陽離子在細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空變化水平，以期揭示出它是如何觸發(fā)細(xì)胞生理響應(yīng)的[2]。細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平常常呈現(xiàn)出諸如“尖峰形成”和細(xì)胞內(nèi)“鈣波”形式的變化、被認(rèn)為是細(xì)胞間觸發(fā)信息傳遞的方式。解碼Ca2+“指紋”的生物化學(xué)耦聯(lián)，使得Ca2+信號(hào)能夠參與細(xì)胞對(duì)多種環(huán)境刺激響應(yīng)的調(diào)節(jié)。Ca2+濃度過高時(shí)、它也是一種細(xì)胞毒素，在胞質(zhì)中其濃度為100 nM水平、而在細(xì)胞器內(nèi)或質(zhì)外體Ca2+濃度大致在在 1 mM水平。在細(xì)胞質(zhì)中，一旦 Ca2+濃度超出 100 μM 水平時(shí)間過長，細(xì)胞功能將會(huì)因Ca2+沉積而遭到破壞。然而，Ca2+濃度在 100 μM 水平上的增加，如果在時(shí)空上受到限制，細(xì)胞是可以耐受的。最典型的是植物根尖生長點(diǎn)和伸長區(qū)細(xì)胞[3]。因此，對(duì)Ca2+濃度動(dòng)態(tài)變化模式的監(jiān)測是研究Ca2+信號(hào)的關(guān)鍵。 然而，Ca2+濃度瞬時(shí)變化的定位與成像卻面臨諸多挑戰(zhàn)。因?yàn)楸O(jiān)測細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度的系統(tǒng)必須足夠靈敏、而且能夠檢測到100 μM 濃度范圍Ca2+的變化、并且要避免其他二價(jià)離子如Mg2+的干擾。

廣泛用來進(jìn)行植物細(xì)胞Ca2+顯像的染料，都含有一族碳酸殘基。這些染料通過碳酸殘基與Ca2+相互作用，使得其自身的熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。例如，Ca2+熒光染料Green-1，Ca2+濃度從0到 μM 水平上的變化，可以使其熒光染料發(fā)光強(qiáng)度增加上百倍(圖1)。可以借助激光共聚焦或熒光顯微鏡，用肉眼觀察Ca2+染料熒光強(qiáng)度的增加，進(jìn)而推斷Ca2+濃度水平的變化。 一旦知道Ca2+探針的解離系數(shù)，可以用簡單的公式來確定Ca2+濃度變化：

Ca2+濃度= Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]

上式中Kd為Ca2+對(duì)Ca2+染料的解離系數(shù)；F是測定的熒光強(qiáng)度；Fmax是飽和熒光強(qiáng)度； Fmin是無Ca2+時(shí)的熒光強(qiáng)度[4]。

在使用以上描述過的方法過程中，人們發(fā)現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescent resonance energy transfer，F(xiàn)RET)，這一基于Ca2+綠色熒光受體蛋白(green fluorescent proteins， GFPs)的轉(zhuǎn)基因新技術(shù)，對(duì)于信號(hào)檢測來說是很有吸引力的一項(xiàng)新技術(shù)。Palmer等[5]分析研究了熒光共振能量轉(zhuǎn)移等成熟的技術(shù)方法，在實(shí)踐中有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

1.2 向植物細(xì)胞內(nèi)加載Ca2+染料的方法

能與Ca2+相互作用的染料，均含有強(qiáng)烈的帶電基團(tuán)、使得它們不易進(jìn)入細(xì)胞。因此，要使Ca2+染料順利進(jìn)入植物細(xì)胞，確實(shí)是個(gè)不小的挑戰(zhàn)。使細(xì)胞膜可逆性溶解或撕裂的技術(shù)，如電穿孔、去污劑增溶、微注射、膜片鉗、顆粒型傳送、或其它酸酯掩蓋電荷的方法，均可使染料順利進(jìn)入植物細(xì)胞[6-7]。值得一提的是，染料在胞質(zhì)和細(xì)胞器內(nèi)加載積累后、保持其完整性十分重要。因此，目前與葡聚糖相結(jié)合的染料分子、經(jīng)顯微注射加載進(jìn)入細(xì)胞的方法受到廣泛重視[8]。

圖1 Ca2+敏感的熒光染料和綠色熒光蛋白的特性[1]

(a)Ca2+傳感染料Calcium Green-1，F(xiàn)ura-2和 Indo-1熒光發(fā)射與激發(fā)波普。這些染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：(i) Ca2+結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加的波長，(ii)Ca2+結(jié)合后熒光強(qiáng)度不同步增加的輻射波長，(iii) Ca2+結(jié)合后熒光強(qiáng)度下降的波長。(b) 彩色表示波普的范圍。(c) Ca2+響應(yīng)的Ca2+傳感蛋白：鈣調(diào)素(calmodulin)結(jié)構(gòu)域在2個(gè)Ca2+結(jié)合的能量轉(zhuǎn)移伴侶蛋白CFP和YFP之間；鈣調(diào)素結(jié)合Ca2+后，蛋白構(gòu)象的改變使得CFP與YFP接近、FRET出現(xiàn)后導(dǎo)致激發(fā)態(tài)光產(chǎn)生。(d ) Ca2傳感蛋白的熒光發(fā)射波普。Ca2+水平增加, CFP (FRET 供體) 輻射減弱, 而YFP (FRET 受體) 輻射增加?？s略語： 青色熒光蛋白CFP, cyan fluorescent protein；熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET, fluorescence resonance energy transfer；黃色熒光蛋白YFP, yellow fluorescent protein。

2 植物細(xì)胞pH值熒光顯微成像

與Ca2+相似，質(zhì)子作為帶電離子必須嚴(yán)格控制在合適的濃度。H+參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、而且直接影響植物發(fā)育。鑒于此，測量細(xì)胞pH是植物學(xué)家們的一個(gè)重要目標(biāo)。傳統(tǒng)上講，人們一般用選擇性質(zhì)子微電極等方法來對(duì)細(xì)胞pH進(jìn)行測量。這些技術(shù)雖得到應(yīng)用， 但有很多不足，如分辨率低、時(shí)間響應(yīng)滯后等。傳統(tǒng)的測細(xì)胞pH值的微電極方法，在實(shí)踐上仍有很多不足。由于pH在細(xì)胞內(nèi)也是動(dòng)態(tài)變化的，因此用熒光指示劑捕獲這一動(dòng)態(tài)變化過程，是測定pH極佳的方法[9]。

2.1 質(zhì)外體pH

質(zhì)外體是植物細(xì)胞膜外區(qū)域，包括細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙和木質(zhì)部。這一區(qū)域的離子環(huán)境會(huì)影響物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，尤其直接影響根部的營養(yǎng)吸收和溶質(zhì)傳輸。細(xì)胞壁的pH也調(diào)整其延展性與穩(wěn)定性、進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀的大小。植物激素在質(zhì)外體的運(yùn)輸，也會(huì)受到質(zhì)子化水平的影響。撇開細(xì)胞壁pH對(duì)植物眾多生理功能的影響不談，測定其數(shù)值仍然是確定質(zhì)外體pH對(duì)生長發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵。有許多方法都是利用共聚焦顯微鏡來觀察熒光探針對(duì)質(zhì)外體pH的標(biāo)記。指示劑一般是用熒光粉或其衍生物來充當(dāng)[10]。熒光粉染料通常被用來作為雙重激發(fā)態(tài)比例指示劑，即一方面其一個(gè)激發(fā)態(tài)峰值的形成完全不依賴于細(xì)胞pH值、另一方面其第二個(gè)激發(fā)態(tài)峰值的形成完全依賴pH值。細(xì)胞pH值可根據(jù)二者激發(fā)態(tài)強(qiáng)度變化，按比例計(jì)算出來。目前細(xì)胞pH值的測定大體都按這種方式進(jìn)行，代表著該技術(shù)的新方向。

2.2 細(xì)胞質(zhì)pH監(jiān)測

由于細(xì)胞溶質(zhì)是強(qiáng)緩沖液、加之H+-ATP質(zhì)子泵和多聚焦磷酸化的作用，植物細(xì)胞pH一般情況下維持在7.2左右。H+-ATP質(zhì)子泵一般定位在細(xì)胞質(zhì)膜和內(nèi)膜上，其工作結(jié)果是去除胞質(zhì)過多H+。最近有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)pH值也受到了精巧的調(diào)節(jié)、以期響應(yīng)外界刺激或植株生長[11]。

當(dāng)前，靈敏的熒光pH探針與高分辨率的空間圖像相偶聯(lián)，不僅使得人們可以使用熒光顯微鏡觀察亞細(xì)胞水平pH值的不均一性、而且可以觀察到不同細(xì)胞pH值的動(dòng)態(tài)變化。基于熒光顯微鏡使用的靈敏細(xì)胞質(zhì)pH熒光染料一直是觀察和測定胞質(zhì)pH的首選方法。目前，胞質(zhì)pH熒光蛋白瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)受到研究和使用者的歡迎，該技術(shù)還在發(fā)展之中。

3 植物細(xì)胞ROS活體原位成像

3.1 單線態(tài)氧細(xì)胞成像探針

3.2 超氧陰離子細(xì)胞成像

圖2 4 d 擬南芥根尖50- μM H2DCF-DA染色結(jié)果[1]

(a) H2DCF-DA 染色和加載的時(shí)間進(jìn)程；(b) 單個(gè)根尖細(xì)胞光漂白、染料吸收和泄漏，以及氧化還原勢的不同復(fù)合狀態(tài)；(c) 根尖加載H2DCF-DA 10 min后, 激光共聚焦顯微成像，然后再根據(jù)要求掃描目標(biāo)區(qū)域活性氧；(d) 總作用時(shí)間為26 s，掃描結(jié)束后，表皮外周細(xì)胞染色因光漂白逐漸變暗，而毗鄰的細(xì)胞因成像脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS變亮。

3.3 過氧化氫顯像探針

二氨基聯(lián)苯(3,3-Diaminobenzidine， DAB)是水溶性有機(jī)化合物，能與過氧化氫(H2O2)起反應(yīng)，生成深褐色多聚物[19]。與NBT使用方式相仿，DAB被用來進(jìn)行植物生物脅迫或傷害脅迫條件下H2O2原位顯色。值得注意的是DAB對(duì)植物細(xì)胞有毒性，并且易于被光降解。熒光素衍生物2,7-二氯熒光黃(dihydrodichlorofluorescein diacetate， H2DCF-DA)目前被廣泛作為過氧化氫實(shí)時(shí)顯像熒光探針[19,24]。由于與H2O2的高反應(yīng)活性且可以直接通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，H2O2已被普遍用來監(jiān)測植物細(xì)胞H2O2的積累(圖2)。與其他ROS染料或傳感器相比，H2DCF-DA具有可視化程度高、加載進(jìn)入細(xì)胞方便等優(yōu)點(diǎn)，但是該染料探針在完整細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定、易于發(fā)生光氧化或光猝滅作用。在應(yīng)用中宜快、不宜慢。

4 總結(jié)和展望

熒光探針為確定植物細(xì)胞Ca2+、pH和ROS的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具和辦法。 隨著人們對(duì)熒光探針與目標(biāo)信號(hào)分子相互作用模式認(rèn)識(shí)的深入，這些探針在對(duì)信號(hào)分子定量分析方面將起十分重要的作用。盡管本文討論僅限于Ca2+、pH和ROS探針，但是更廣泛的染料和修飾化GFP熒光蛋白感受器、已經(jīng)被用來監(jiān)測G-蛋白活性、蔗糖濃度和酶活性等[25]。熒光蛋白感受器的出現(xiàn)，使得顯微成像更為容易、尤其是用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞、可以免除染料添加等定位試驗(yàn)。期待著能有一個(gè)熒光蛋白數(shù)據(jù)庫資源，屆時(shí)亞細(xì)胞信號(hào)定位方面的試驗(yàn)開展將更為便捷，也可以豐富人們對(duì)亞細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)變化的理解。目前，由于可以獲取多個(gè)熒光探針，因而可以同時(shí)測定多個(gè)細(xì)胞位點(diǎn)多個(gè)參數(shù)。這種多渠道獲取的熒光圖像，無疑對(duì)于我們確定亞細(xì)胞水平上標(biāo)志性信號(hào)元件、有至關(guān)重要的作用。

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