李瑞華，曲 杰，王 寧

(1.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院，遼寧 大連 116044)

醫(yī)學檢驗

大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群基因檢測與耐藥率的研究

李瑞華1，曲 杰1，王 寧2

(1.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院，遼寧 大連 116044)

目的通過檢測大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群基因及細菌耐藥率，探討兩者間的關系。方法篩選ESBLs陽性菌株88例，通過多重PCR方法檢測ChuA, YjaA 和 TspE4.C2基因；應用Vitek2 compact細菌自動鑒定及藥敏分析儀檢測細菌耐藥率。結果大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群以D群57.95%為主，其余依次為A群20.45%、B2群14.78%、B1群6.82%。其中在痰標本中檢出率A群、D群比例基本相當，但在其他標本中均以D群為主。B2群耐藥率顯著高于A群、D群(除外LEV)分離的菌株(P<0.05)。結論根據系統(tǒng)發(fā)育群基因檢測，大腸埃希菌主要為D群為主，其次分別為A、B2、B1群。不同的系統(tǒng)發(fā)育群所表現的耐藥性不同，其中毒力最強的B2群耐藥率最高。

大腸埃希菌；系統(tǒng)發(fā)育群； ChuA；YjaA；TspE4.C2

大腸埃希菌是臨床常見的條件致病菌，也是醫(yī)院感染常見的病原菌。隨著抗生素的廣泛使用，大腸埃希菌的耐藥問題更加嚴峻。其中產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)成為最常見的耐藥機制，其可在不同菌群、菌株之間水平傳遞，常引起院內感染的暴發(fā)流行[1]。因此，對于ESBLs陽性菌耐藥性的深入研究對指導臨床用藥十分重要。大腸埃希菌根據其系統(tǒng)發(fā)育群的研究，可分為A、B1、B2、D 4群[2]。不同的系統(tǒng)發(fā)育群所表現的致病能力也不同，其中，毒力最強的是B2群，其次是D群[3]。本研究對臨床分離出來的88例ESBLs陽性的大腸埃希菌進行系統(tǒng)發(fā)育群和耐藥率的檢測，以了解其耐藥性與發(fā)育群的關系。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集2012年4月—12月大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院臨床分離出的88株ESBLs陽性大腸埃希菌，剔除重復菌株。標本來自患者痰液(13株)，尿液(35株)，血液(18株)，胸、腹水(3株)，膿汁(6株)，膽汁(7株)，分泌物(2株)，穿刺液(4株)等。標準質控菌株：陰溝腸桿菌ATCC700323;大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 主要儀器及試劑

細菌鑒定和藥敏試驗判定由VITEK 2 compact 型全自動細菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)完成，藥敏折點使用CLSI 2012年判定標準。引物由大連寶生物工程有限公司合成；PCR反應由天根生化科技有限公司研制的一管便攜式PCRMastermix完成。

1.3 DNA的提取

煮沸法提取細菌DNA做為模板。

1.4 多重PCR擴增

用多重PCR法檢測88株細菌中的系統(tǒng)發(fā)育群基因，引物設計及產物判斷參見文獻[2]，所用引物見表1。

表1 ChuA、YjaA、TspE4.C2基因的引物

PCR檢測發(fā)育群基因反應體系：反應體系共25 μL。反應液12.5 μL,每條引物各1 μL，模板2 μL。反應條件：預變性94℃×5 min; 共30個循環(huán):94℃×30 s，55℃×30 s，72℃×30 s，最后延伸72℃×7 min。

PCR產物電泳： 2%瓊脂糖50 mL+1 μL溴化乙錠，100 V，穩(wěn)壓電泳20～30 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照閱讀結果。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，兩組率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PCR產物電泳凝膠成像結果

PCR產物經電泳凝膠成像，其中ChuA在279 bp，YjaA在211 bp，TspE4.C2在152 bp處出現清晰條帶。通過對基因條帶的分析來確定屬于A群、D群、B2群、B1群。見圖1。

2.2 大腸埃希菌檢測系統(tǒng)發(fā)育群結果

比例最大的是D群為57.95%，其余依次為A群(20.45%)、B2群(14.78%)、B1群(6.82%)。通過分析大腸埃希菌主要來源可以看出，在痰標本中A群、D群相等，其余標本中均以D群為主。見表2。

圖1部分攜帶ChuA、YjaA、TspE4.C2基因菌株PCR產物電泳結果

Fig 1 Partial electrophoretic result of ChuA, YjaA and TspE4.C2

1為A群；2,3,6為D群；5為B2群；7為B1群；4為Marker

M：DL2000TM,DNA Marker 1：groupA；2,3,6：groupD；5：groupB2；7：group B1

2.3 系統(tǒng)發(fā)育群與常用抗生素耐藥率關系

大腸埃希菌ESBL陽性株對亞胺培南、美羅培南的耐藥率為零；對哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、呋喃妥因的耐藥率較低；但是，對頭孢呋辛、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率達到了85%以上。

其中屬于B2群的大腸埃希菌對于左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、頭孢他啶的耐藥率顯著高于A群、D群(除外LEV)分離的菌株，差異有顯著性意義(P<0.05)。見表3。

表2 大腸埃希菌按主要來源系統(tǒng)發(fā)育群比例

表3 系統(tǒng)發(fā)育群與藥物耐藥率比較

1)與A群、D群耐藥率比較，P<0.05

CAZ：頭孢他啶；TZP:哌拉西林/他唑巴坦；AK：阿米卡星；LEV：左氧氟沙星；F：呋喃妥因；CIP：環(huán)丙沙星

3 討 論

大腸埃希菌根據其系統(tǒng)發(fā)育群可以分為A、B1、B2、D 4群。對于系統(tǒng)發(fā)育群的檢測有以下幾種方法，脈沖場凝膠電泳(PFGE)，隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)，多基因酶促電泳[4]等，但是這些方法費時又費力。后來，Clermont等[5]通過標記3個目的基因ChuA, YjaA 和 TspE4.C2，以簡便的方法檢測出系統(tǒng)發(fā)育群。ChuA腸出血性大腸埃希菌O157：H7中血紅素運輸所需的基因；YjaA是通過基因組序列在K-12大腸埃希菌中被確定的基因，其功能還不完全了解；TspE4.C2是消減文庫中的匿名的DNA片段。本研究按照此種方法進行檢測，選取3種目的基因以PCR方法對其進行擴增，再通過瓊脂糖凝膠電泳，分別在152 bp,211 bp,279 bp處呈現出3條清晰的條帶，其中D群只在279 bp處出現1條條帶，或伴152 bp處有條帶；B2群會在279 bp,211 bp處出現兩條條帶，或伴152 bp處有條帶；B1群在279 bp、211 bp處沒有條帶，在152 bp處有1條帶；而A群在279 bp、152 bp、211 bp處均不會出現條帶或僅在279 bp處有條帶，這樣就可以清晰地分析出各個系統(tǒng)發(fā)育群。

文獻顯示不同的地區(qū)各個系統(tǒng)發(fā)育群所占的比例可不同，Saira Bashir等[6]通過對巴基斯坦地區(qū)的研究指出所占比例最高的為B2群，其次為D群。黎曉強等[3]對廣州地區(qū)系統(tǒng)發(fā)育群的研究表明D群為主要部分。本研究檢測結果顯示大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群以D群57.95%為主，其余依次為A群(20.45%)、B2群(14.78%)、B1群(6.82%)。通過對大腸埃希菌主要來源的分析可以發(fā)現，血、尿標本中都以D群為主，痰液標本中D群、A群比例相差不大，說明目前大連地區(qū)大腸埃希菌主要系統(tǒng)發(fā)育群可能以D群為主。

產ESBLs的大腸埃希菌在臨床分離率達到60%～68.8%[7-8]，對于其耐藥性的深入研究具有一定的代表性。本研究所選的大腸埃希菌為產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)陽性菌株，均對頭孢曲松耐藥，通過對其耐藥性的研究發(fā)現，大部分抗生素的耐藥率在50%以上，但對哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亞胺培南和美羅培南高度敏感。故碳青霉烯類抗菌藥物可作為首選的治療藥物，用于治療重大感染；其次可以選用β-內酰胺酶抑制劑復合物及阿米卡星。但是阿米卡星具有一定的腎毒性，在用藥時應注意。頭孢替坦、頭孢吡肟也有很好的治療效果。其他類藥物均呈現不同程度耐藥，臨床治療時應避免使用。

不同的系統(tǒng)發(fā)育群所具有的毒力因子不同，有報道指出毒力最強的是B2群，可以檢測出3個或以上毒力因子，其次是D群可以檢測出2～3個毒力因子[3]。通過對系統(tǒng)發(fā)育群與耐藥率關系的分析可以得出，對于左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、頭孢他啶4種藥物,B2群的耐藥率顯著高于A群、D群(除外LEV)(P<0.05)?？赡芘c其檢測出的毒力因子多于其他群有關。至于毒力因子與耐藥性的關系有待進一步研究。因B1群數量較少，沒有進行統(tǒng)計分析。另外此次試驗由于菌株數量偏少，可能代表性不是很強，還需要試驗進一步驗證。

[1]方家敏,鈕博,韓瑋瑋,等.大腸埃希菌耐藥性的研究進展[J].實用醫(yī)技雜志，2011,18(5)：498-500.

[2]Olivier Clermont, Stephane Bonacorsi,Edouard Bingen.Rapid and Simple Determination of the Escherichia coli Phylogenetic Group[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(10):4555-4558.

[3]黎曉強,卓超,廖東江,等.廣州地區(qū)產CTX-M-15的大腸埃希菌的系統(tǒng)發(fā)育群的研究[J].中華檢驗醫(yī)學雜志, 2010，2：152-154.

[4]Moreno E,Prats G,Sabaté M,et al.Quinolone, fluoroquinolone and trimethoprim sulfamethoxazole resistance in relation to virulence determinants and phylogenetic background among uropathogenic Escherichia coli[J].J Antimicrob Chemother,2006, 57:204-211.

[5]Clermont O, Bonacorsi S, Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic groups[J].Appl Environ Microbiol, 2004,66: 4555-4558.

[6]Saira Bashir,Yasra Sarwar,Aamir Ali,et al. Multiple drug resistance patterns in various phylogenetic groups of uropathogenic E.coli isolated from Faisalabad region of Pakistan Health Biotechnology Division[J]. National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering (NIBGE), 2008, 577:1235-1238.

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[8]張智潔,王軍,孫繼梅,等.衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網2010年東北地區(qū)細菌耐藥監(jiān)測[J].中國臨床藥理學雜志,2011(12):948-975.

StudyofPhylogeneticgroupgenesanddrugresistanceofescherichiacoli

LIRui-hua1,QUJie1,WANGNing2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China;2.LaboratoryMedicineInstitute,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo investigate and discuss the relation between the Phylogenetic Groups and drug resistance of Escherichia coli.MethodsA total of 88 strains Escherichia Coli of ESBLs producing were collected, which were isolated from the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University. The detection of Phylogenetic Groups gene: ChuA,YjaA and TspE4.C2 is through PCR-based assays and agarose gel electrophoresis. The drug resistance is completed by Vitek2 compact automatic identification of bacterial drug resistance analysis of systems.Results88 strains E. coli isolates majority belonged to phylogenetic group D (57.95%), where as 20.45% belonged to groups A, 6.82% belong to groups B1, and 14.78% to group B2. Among the bacterial strain which come from respiratory system,group A and group D are nearly equal, but the mainly group in other systems are group D. During these Phylogenetic Groups,the drug resistance of group B2 is the highest one.ConclusionThe major phylogenetic group of Escherichia Coli is group D, then group A, B2, B1. The drug resistance of group B2 is the highest one.

Escherichia coli; Phylogenetic Groups; ChuA; YjaA; TspE4.C2

10.11724/jdmu.2013.02.18

R978.11

A

1671-7295(2013)02-0167-03

李瑞華，曲杰，王寧. 大腸埃希菌系統(tǒng)發(fā)育群基因檢測與耐藥率的研究[J].大連醫(yī)科大學學報，2013,35(2)：167-169，192.

李瑞華(1972-)，女，遼寧朝陽人，副主任技師，碩士。E-mail:lrhzyp2006@163.com

2012-12-21；

2013-03-09)