王曉佳，秦婷婷，胡 霞，胡 纖，黃銀春，張洪茂

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子與行為生態(tài)學(xué)研究組，武漢 430079)

復(fù)合不育劑EP-1對(duì)小鼠空間記憶與焦慮行為的影響

王曉佳，秦婷婷，胡 霞，胡 纖，黃銀春，張洪茂*

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子與行為生態(tài)學(xué)研究組，武漢 430079)

EP-1是由炔雌醚和左炔諾孕酮按照1∶2的比例配制而成的一種用于鼠類(lèi)不育控制的激素類(lèi)復(fù)合不育劑，對(duì)鼠類(lèi)的繁殖及繁殖行為等有一定影響，但對(duì)鼠類(lèi)空間學(xué)習(xí)與記憶、焦慮行為等非繁殖行為的影響還沒(méi)有報(bào)道。為此，用0 (對(duì)照)、1.0、2.0、3.0 mg/kg劑量的EP-1對(duì)昆明小鼠(Musmusculus)進(jìn)行灌胃處理，然后用Morris水迷宮和高架十字迷宮分別測(cè)定其空間記憶、焦慮行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃后15 d，劑量為2.0 mg/kg的EP-1使小鼠空間記憶能力顯著下降，但30 d后其空間記憶能力有所恢復(fù)，表明2.0 mg/kg劑量的EP-1可以在一定時(shí)間范圍內(nèi)降低小鼠的空間記憶能力。但不同劑量的EP-1對(duì)小鼠焦慮行為無(wú)顯著影響。該結(jié)果可以為從對(duì)非繁殖行為的影響的角度研究EP-1對(duì)鼠類(lèi)的作用提供一定啟示。

昆明小鼠(Musmusculus)；EP-1；空間記憶；焦慮

不育控制是借助某種技術(shù)和方法使雄性或雌性不育，或阻礙胚胎著床發(fā)育，甚至阻斷幼體生長(zhǎng)發(fā)育，以降低鼠類(lèi)的生育率，達(dá)到控制其種群數(shù)量和密度的目的，其本質(zhì)是生育控制[1- 2]。不育控制技術(shù)因其效果持久、生態(tài)安全等特點(diǎn)而備受關(guān)注[1,3]。

EP-1是由炔雌醚(quinestrol)和左炔諾孕酮(levonorgestrel)按照1∶2的比例配制，用于鼠類(lèi)不育控制的激素類(lèi)復(fù)合不育劑，能對(duì)多種鼠類(lèi)的繁殖和繁殖行為產(chǎn)生不同程度的抑制作用[4]。例如EP-1可以降低布氏田鼠(Lasiopodomysbrandtii)、灰倉(cāng)鼠(Cricetulusmigratorius)和子午沙鼠(Merionesmeridianus)等鼠類(lèi)的產(chǎn)仔率、產(chǎn)仔窩次數(shù)、胎仔數(shù)、延長(zhǎng)產(chǎn)仔時(shí)間等[4]；可以有效降低大倉(cāng)鼠(Tscherskiatriton)[5- 6]、黑線毛足鼠(Phodopuscampbelli)[7]、高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)[8]、長(zhǎng)爪沙鼠(Merionesunguiculatus)[9]等的種群繁殖力、種群數(shù)量，產(chǎn)生明顯的抗生育作用；此外EP-1還可以使雄性大倉(cāng)鼠的繁殖器官明顯萎縮，變小[6]。但也有報(bào)道認(rèn)為EP-1對(duì)雌性布氏田鼠的抗生育作用不明顯[10- 11]。然而，EP-1除了以生殖系統(tǒng)為作用靶標(biāo)，直接影響鼠類(lèi)與繁殖相關(guān)的生理過(guò)程和行為外，還可能影響非繁殖行為及其生理過(guò)程，例如空間記憶、焦慮等[12]，間接地影響鼠類(lèi)的生存和繁殖，進(jìn)而達(dá)到控制害鼠種群數(shù)量和密度的效果?？臻g記憶能力喪失或降低，過(guò)度焦慮等對(duì)人和鼠類(lèi)的健康乃至生存具有重要影響[13- 14]。例如空間記憶能力減弱可能導(dǎo)致動(dòng)物難以尋找食物和躲避危險(xiǎn)而危及生存[15]；持續(xù)焦慮會(huì)引起人或動(dòng)物行為異常、代謝紊亂而危及健康[16]。激素類(lèi)藥物會(huì)影響鼠類(lèi)空間記憶和焦慮已有少量報(bào)道，例如雙酚A(bisphenol A)可以降低雄性小鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力，并且可以導(dǎo)致雄性小鼠的焦慮行為[12]；孕酮(progesterone)可以導(dǎo)致大鼠與小鼠在高架十字迷宮中的焦慮行為[17]。但尚無(wú)關(guān)于EP-1影響鼠類(lèi)空間記憶和焦慮的報(bào)道，評(píng)估EP-1對(duì)鼠類(lèi)的綜合作用效果時(shí)也常常忽略了EP-1對(duì)鼠類(lèi)空間記憶、焦慮等非繁殖行為的影響。

為此，以小鼠在水迷宮(MWM)中的逃逸潛伏期、目標(biāo)象限滯留時(shí)間、穿越逃逸平臺(tái)次數(shù)為空間記憶指標(biāo)，以小鼠在高架十字迷宮(EPM)內(nèi)開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間為焦慮行為指標(biāo)，分別研究了不同劑量的EP-1在不同時(shí)間段對(duì)昆明小鼠(Musmusculus)空間記憶和焦慮的影響，以探索EP-1能否對(duì)鼠類(lèi)的空間記憶及焦慮產(chǎn)生影響，為從對(duì)非繁殖行為影響的角度研究和評(píng)估EP-1對(duì)鼠類(lèi)的作用提供一定啟示和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)鼠及分組

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

按照1∶2的比例將炔雌醚和左炔諾孕酮溶解于花生油(魯花牌)中，分別配制成1.0、2.0、3.0 mg/mL的EP-1溶液，并以花生油為對(duì)照。每天18:00—19:00用小鼠灌胃器(zc14000, 武漢博馳生物科技有限公司)對(duì)各組小鼠灌胃，連續(xù)給藥15 d，每5 d測(cè)定一次小鼠體重。給藥結(jié)束后以正常飼料飼養(yǎng)。

Morris水迷宮(MWM)實(shí)驗(yàn):該實(shí)驗(yàn)分別在給藥結(jié)束后15 d與30 d各進(jìn)行1次，每次連續(xù)訓(xùn)練5d。以經(jīng)典Morris準(zhǔn)則使用MWM測(cè)定空間學(xué)習(xí)與記憶[18]。MWM(DB001, 淮北正華生物儀器有限公司)由黑色圓柱形恒溫游泳水池(直徑120 cm, 高40 cm)，黑色隱藏平臺(tái)(直徑8 cm，高21 cm)及攝像與記錄系統(tǒng)組成，置于控溫房間內(nèi)，并用黑色不透光布簾罩住，以保證穩(wěn)定的測(cè)試環(huán)境和避免實(shí)驗(yàn)鼠利用其它的空間記憶線索。實(shí)驗(yàn)時(shí)在水池四周做4個(gè)迷宮標(biāo)記，將水池分為4個(gè)象限，隱藏平臺(tái)所在的區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)象限，水深22 cm，水溫(22±1) ℃。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將小鼠頭面對(duì)水池墻壁上的標(biāo)記，由任一象限入水，并利用攝像系統(tǒng)記錄小鼠對(duì)隱藏平臺(tái)的尋找。設(shè)定找尋時(shí)間60 s，小鼠在60 s內(nèi)找到隱藏平臺(tái)并滯留3 s及以上，視為逃逸成功，從動(dòng)物入水至逃逸成功所用時(shí)間記為逃逸潛伏期。如果小鼠60 s內(nèi)未找到隱藏平臺(tái)(未成功逃逸)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至隱藏平臺(tái)上適應(yīng)30 s，以幫助小鼠學(xué)習(xí)，逃逸潛伏期記為60 s。每只小鼠分別在四個(gè)象限連續(xù)訓(xùn)練5 d。用逃逸潛伏期表示小鼠的學(xué)習(xí)能力。然后撤去平臺(tái)，在任意一非目標(biāo)象限放入小鼠，記錄其目標(biāo)象限滯留時(shí)間和穿越隱藏平臺(tái)次數(shù)，以測(cè)試其空間記憶(尋找隱藏平臺(tái))能力。

高架十字迷宮(EPM)測(cè)試:該實(shí)驗(yàn)在水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后第2天進(jìn)行。EPM測(cè)試是研究嚙齒類(lèi)動(dòng)物焦慮的經(jīng)典試驗(yàn)方法[17]。EPM(XR-XG201, 武漢一鴻科技有限公司)“十”型平臺(tái)距離地面50 cm，由兩條相對(duì)開(kāi)臂(50 cm長(zhǎng)×10 cm寬)和兩條相對(duì)閉合臂(50 cm長(zhǎng)×10 cm寬×40 cm高)及中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)組成，置于暗室內(nèi)(80 lx)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將動(dòng)物背對(duì)實(shí)驗(yàn)者面對(duì)開(kāi)臂放入迷宮中央?yún)^(qū)，隨后5min內(nèi)用攝像機(jī)記錄小鼠在迷宮里的活動(dòng)情況。為了消除不同次測(cè)試間的相互影響，每次測(cè)試結(jié)束后立即清除小鼠糞便，用醫(yī)用酒精(75%濃度)擦洗迷宮，并閑置30min待酒精揮發(fā)后再進(jìn)行下一次測(cè)試。用ANY-MAZE軟件分析動(dòng)物開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間，以此反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的焦慮狀態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用Mann-Whitney U Test分別對(duì)水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃逸潛伏期，目標(biāo)象限滯留時(shí)間、平均穿越平臺(tái)次數(shù)，以及對(duì)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)、開(kāi)臂滯留時(shí)間進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的兩兩比較。

2 結(jié)果

Morris水迷宮測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)5 d尋找隱藏平臺(tái)訓(xùn)練，四組小鼠的逃逸潛伏期迅速下降，到第5天時(shí)達(dá)較精準(zhǔn)水平。給藥后15 d，與對(duì)照組相比，各處理組鼠的逃逸潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng)，但1.0 mg/kg組、3.0 mg/kg組無(wú)顯著性差異，2.0 mg/kg組在水迷宮訓(xùn)練的第5天 (Z= -2.893,P= 0.004)有極顯著性差異(圖1)。給藥后30 d，各處理組鼠的逃逸潛伏期較對(duì)照組延長(zhǎng)，水迷宮訓(xùn)練的第1天 1.0 mg/kg組(Z= -2.463,P= 0.014), 2.0 mg/kg組(Z= -2.163,P= 0.031)小鼠差異顯著，但第2天，第3天，第4天，第5天無(wú)顯著差異(圖1)。

圖1 不同劑量EP-1灌胃后15 d、30 d小鼠在水迷宮內(nèi)的逃逸潛伏期Fig. 1 Escape latency of Mus musculus within Morris water maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤; * (P lt; 0.05), ** (P lt; 0.01)表示與對(duì)照組差異顯著

給藥后15 d，2.0 mg/kg組(Z= -2.911,P= 0.004)和3.0 mg/kg組(Z= -2.654,P= 0.008)小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的滯留時(shí)間較對(duì)照組顯著減少；給藥后30 d，處理組小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的滯留時(shí)間較對(duì)照組無(wú)顯著差異(圖2)。與對(duì)照組相比，給藥后15 d, 2.0 mg/kg組平均穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著減少(Z= -2.459,P=0.014)，1.0 mg/kg組、3.0 mg/kg組無(wú)顯著差異；給藥后30 d，各組平均穿越平臺(tái)次數(shù)較對(duì)照組均無(wú)顯著差異(圖2)。

圖2 不同劑量EP-1灌胃后15 d、30 d小鼠在水迷宮內(nèi)目標(biāo)象限滯留時(shí)間和平均穿越平臺(tái)次數(shù)Fig. 2 Retention time and frequency in crossing the hidden platform of Mus musculus in the target quadrant of Morris water maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤; * (P lt; 0.05), ** (P lt; 0.01)表示與對(duì)照組差異顯著

高架十字迷宮測(cè)定結(jié)果顯示，給藥后15 d，30 d各處理組小鼠開(kāi)臂滯留時(shí)間、開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)較對(duì)照組均無(wú)顯著差異(Pgt; 0.05, 圖3)。

在班級(jí)管理過(guò)程中，評(píng)優(yōu)是對(duì)學(xué)生積極性的激發(fā)，是對(duì)學(xué)生努力成果的肯定，讓學(xué)生樹(shù)立自信，完善他們的人格，對(duì)學(xué)生今后的發(fā)展有著深遠(yuǎn)的意義。結(jié)果是一件事情發(fā)展到最后的成果，而過(guò)程是結(jié)果的前提，沒(méi)有過(guò)程就沒(méi)有一個(gè)完美的結(jié)果，不注重過(guò)程不會(huì)體會(huì)到成長(zhǎng)的艱辛和樂(lè)趣，因此，評(píng)優(yōu)推先要重視過(guò)程，認(rèn)真對(duì)照過(guò)程記錄，關(guān)注學(xué)生的習(xí)慣養(yǎng)成，讓優(yōu)秀者名副其實(shí)，真正擁有榜樣作用；讓落評(píng)者從成長(zhǎng)過(guò)程中找出不足，通過(guò)努力，追趕先進(jìn)，最終形成你追我趕，擁有正能量的班集體。

圖3 不同劑量EP-1灌胃后第15天、30天小鼠在高架十字迷宮內(nèi)開(kāi)臂滯留時(shí)間和開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)Fig.3 Time spent in open arms and entries into open arms of Mus musculus in the elevated plus maze at 15 d and 30 d after EP-1 gastrogavage平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤

3 討論

結(jié)果表明EP-1處理可以在一定時(shí)間內(nèi)(15 d)導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。動(dòng)物表現(xiàn)為尋找隱藏平臺(tái)的潛伏期顯著延長(zhǎng)，當(dāng)平臺(tái)撤去時(shí)動(dòng)物在隱藏平臺(tái)所在象限滯留時(shí)間和穿越隱藏平臺(tái)次數(shù)明顯減少。該結(jié)果與Ryu 等關(guān)于動(dòng)物在應(yīng)對(duì)外界壓力時(shí)可能出現(xiàn)認(rèn)知缺陷，導(dǎo)致空間記憶能力下降的研究結(jié)果類(lèi)似[19]。但田棟等研究表明雙酚A對(duì)雌性小鼠的空間記憶能力影響不顯著[12]，這可能是不同激素的差異所致。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(30 d)后，小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有所恢復(fù)，表現(xiàn)為隨著EP-1作用時(shí)間延長(zhǎng)，處理組與對(duì)照組小鼠之間逃逸潛伏期的差異性減小，目標(biāo)象限滯留時(shí)間和隱藏平臺(tái)穿越次數(shù)整體降低，處理組與對(duì)照組之間差異不明顯，表明EP-1對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響可能具有可逆性。沈偉等也曾報(bào)道炔雌醚對(duì)雄性長(zhǎng)爪沙鼠生殖器官和繁殖的影響具有可逆性[20]，表明EP-1對(duì)鼠類(lèi)繁殖行為與非繁殖行為的影響可能在一定程度上都具有可逆性。與對(duì)照組相比，處理組小鼠尋找隱藏平臺(tái)潛伏期延長(zhǎng)、在目標(biāo)象限滯留時(shí)間縮短、穿越原平臺(tái)次數(shù)減少，表明EP-1處理可能在一定程度上導(dǎo)致小鼠的認(rèn)知障礙，降低其空間學(xué)習(xí)記憶能力，進(jìn)而可能影響小鼠的生存[15]。自然條件下，空間記憶能力下降或喪失會(huì)危及鼠類(lèi)生存和繁殖，從而可能降低種群密度，達(dá)到控制害鼠的目的[21- 22]。例如，分散貯藏食物的鳥(niǎo)類(lèi)和鼠類(lèi)，很大程度上依靠空間記憶找回食物以度過(guò)食物短缺期，空間記憶下降或喪失，貯食動(dòng)物將無(wú)法找回貯藏食物而危及生存和繁殖，導(dǎo)致種群數(shù)量下降[21- 22]。因此，該結(jié)果可能為從“降低空間記憶、影響生存與繁殖、降低種群密度，有效防控鼠害”的角度探索EP-1對(duì)鼠類(lèi)的影響提供一些啟示和思考方向。

Spielberge 等將焦慮分為特質(zhì)焦慮和狀態(tài)焦慮，特質(zhì)焦慮是相對(duì)持久的、焦慮傾向相對(duì)穩(wěn)定的、個(gè)體差異明顯的焦慮；而狀態(tài)焦慮則是指焦慮的暫時(shí)波動(dòng)狀態(tài)，是由特定的情境引起的[23]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EP-1處理對(duì)小鼠焦慮反應(yīng)無(wú)顯著影響，表現(xiàn)為EP-1處理小鼠和對(duì)照組在高架十字迷宮內(nèi)開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間無(wú)顯著差異。關(guān)于激素與鼠類(lèi)焦慮的關(guān)系已有少量研究結(jié)果，例如雙酚A可使雄性小鼠焦慮，而使雌性小鼠的焦慮有所緩解[12]；孕酮(progesterone)可以導(dǎo)致大鼠與小鼠焦慮行為等[17]，但尚無(wú)EP-1影響鼠類(lèi)焦慮行為的報(bào)道。 EP-1可能導(dǎo)致不同鼠類(lèi)體重減輕，生殖器官萎縮、繁殖行為弱化、繁殖能力下降等[5- 9]。室內(nèi)觀察結(jié)果也表明，EP-1處理會(huì)導(dǎo)致小鼠食量減少、體重減輕、胚胎死亡、親體撫育行為減弱及殺嬰等(王曉佳等，未發(fā)表)。這些結(jié)果表明，EP-1會(huì)導(dǎo)致小鼠身體條件下降，對(duì)環(huán)境壓力的反應(yīng)可能增強(qiáng)，進(jìn)而產(chǎn)生不同程度的焦慮反應(yīng)。該種焦慮反應(yīng)可能屬于Spielberge 等定義的狀態(tài)焦慮，會(huì)隨著不同的情景條件而變化，具有短暫性和波動(dòng)性[23]。測(cè)試的時(shí)間可能錯(cuò)過(guò)了由EP-1引起的小鼠焦慮反應(yīng)時(shí)期，結(jié)果難以否定EP-1刺激小鼠及其它鼠種焦慮反應(yīng)的可能性，因此這方面還需要繼續(xù)研究。

結(jié)果表明EP-1在一定時(shí)間內(nèi)可以導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。這可能是EP-1直接作用的結(jié)果，也可能是EP-1作用于鼠類(lèi)繁殖和繁殖過(guò)程的行為表現(xiàn)，類(lèi)似藥物反應(yīng)副作用。由于個(gè)體差異較大，數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差也較大，意味著測(cè)試存在較大的差異區(qū)間及不同劑量間的重疊，導(dǎo)致結(jié)果具有一定的不確定性。同時(shí)，測(cè)試限于給藥后15 d和30 d，時(shí)間間隔有一定隨意性，結(jié)果體現(xiàn)了兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)EP-1處理和對(duì)照間的差異，但難以反映整個(gè)給藥過(guò)程(30 d) 的行為變化。因此，結(jié)論尚需在更精確的實(shí)驗(yàn)條件下加以驗(yàn)證。但作為新探索之一，該實(shí)驗(yàn)的思路和結(jié)果在探索EP-1對(duì)鼠類(lèi)非繁殖行為的影響方面還是具有某些啟示和借鑒意義。野外條件下，空間學(xué)習(xí)記憶能力下降會(huì)影響鼠類(lèi)的生存和繁殖，導(dǎo)致種群下降，達(dá)到鼠害防控的目的。因此該結(jié)果也可以為從EP-1導(dǎo)致空間記憶能力下降進(jìn)而危及生存和繁殖的角度探索EP-1對(duì)野生鼠的效用提供一定啟示。

致謝:感謝華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廖曉梅博士為水迷宮、高架十字迷宮測(cè)試提供的幫助。

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EffectsofEP-1onspatialmemoryandanxietyinMusmusculus

WANG Xiaojia, QIN Tingting, HU Xia, HU Qian, HUANG Yinchun, ZHANG Hongmao*

MolecularandBehaviouralEcologyGroup,CollegeofLifeSciences,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China

It has been reported that the EP-1, a contraceptive compound composed of levonorgestrel and quinestrol with the ratio of 1∶2, has negative effects on the breeding and reproductive behaviors in some species of mice and rats. However, little is known that the effects of EP-1 on spatial memory and anxiety in mice. Here, the effects of treatment time (15 d and 30 d) and dose (0 mg/kg (control), 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg) of EP-1 on spatial memory and anxiety inMusmusculuswere tested using Morris water maze and elevated plus maze separately. Negative effects of 2.0 mg/kg EP-1 on spatial memory of the subjects were found in 15 days, and this ability recovered in 30 days, implying the 2.0 mg/kg EP-1 can decrease the ability of spatial memory ofM.musculuswithin a period of time. No significant effects were found in all treatments of time and dose of EP-1 on anxiety of the subjects. The results might help to evaluate the effects of EP-1 on mice in respect to non-reproductive behaviors.

anxiety; EP-1;Musmusculus; spatial memory

2012- 06- 09;

2012- 11- 19

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hongmaozhang@gmail.com

10.5846/stxb201206090829

王曉佳，秦婷婷，胡霞，胡纖，黃銀春，張洪茂.復(fù)合不育劑EP-1對(duì)小鼠空間記憶與焦慮行為的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(17):5228- 5233.

Wang X J, Qin T T, Hu X, Hu Q, Huang Y C, Zhang H M.Effects of EP-1 on spatial memory and anxiety inMusmusculus.Acta Ecologica Sinica,2013,33(17):5228- 5233.