劉驍蒨，涂仕華，孫錫發(fā)，辜運(yùn)富，張先琴，張小平,*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物系， 成都 611130； 2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，成都 610066)

秸稈還田與施肥對(duì)稻田土壤微生物生物量及固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響

劉驍蒨1，涂仕華2，孫錫發(fā)2，辜運(yùn)富1，張先琴1，張小平1,*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物系， 成都 611130； 2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，成都 610066)

利用氯仿熏蒸法和變性梯度凝膠電泳法(PCR-DGGE)研究了秸稈覆蓋還田與施肥對(duì)灰棕沖積水稻土0—10cm和10—20cm土層土壤微生物生物量碳、氮和固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：土壤微生物量碳、氮和固氮菌多樣性從0—10cm土層到10—20cm土層均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。無(wú)秸稈覆蓋處理(對(duì)照組)的土壤微生物生物量碳(SMB-C)和微生物生物量氮(SMB-N)量最小。在秸稈覆蓋還田處理中，低氮和無(wú)鉀處理的SMB-C和SMB-N都顯著低于全量氮磷鉀肥處理。雖然無(wú)磷處理的SMB-N低于全量氮磷鉀處理, 但差異不顯著。說(shuō)明秸稈覆蓋還田配施充足氮磷鉀肥能顯著提高土壤微生物生物量碳、氮。由DGGE圖譜多樣性指數(shù)分析得知，配施充足氮磷鉀肥的處理土壤的固氮菌多樣性最豐富。UPGMA聚類分析顯示，10種不同處理的聚類圖也不同，對(duì)照(無(wú)秸稈)處理0—10cm和10—20cm的微生物不同于其它處理單獨(dú)聚在了一個(gè)群里。DGGE條帶測(cè)序得知，14個(gè)條帶的近緣種大部分為非培養(yǎng)細(xì)菌nifH基因片段，主要優(yōu)勢(shì)菌群其歸屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)的β-變形菌綱(Betaproteobacteria)。應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)可以解釋灰棕沖積水稻土秸稈覆蓋不同肥料用量固氮菌分子群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

秸稈還田；灰棕沖積水稻土；微生物生物量；PCR-DGGE；固氮菌群落結(jié)構(gòu)

我國(guó)的秸稈資源十分豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)全國(guó)每年共產(chǎn)生秸稈數(shù)量為6.2億t，約占世界的20%—30%[1]，農(nóng)作物秸稈中蘊(yùn)含有大量的氮、磷、鉀和中、微量元素等礦質(zhì)養(yǎng)分。農(nóng)作生產(chǎn)中產(chǎn)生的大量秸稈被焚燒，造成了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失和嚴(yán)重環(huán)境污染。秸稈還田作為秸稈利用的一種重要且有效的方式，既可以避免資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，同時(shí)也可以增加土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的含量，提高孔隙度，降低土壤容重，還可以提高土壤微生物生物量及增強(qiáng)各種土壤酶的活性[2]，從而使作物更好更快地生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在有機(jī)質(zhì)分解、土壤養(yǎng)分循環(huán)和植物養(yǎng)分吸收利用過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。生物多樣性越高的生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定的Elton假說(shuō)，受到大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同。Tilman通過(guò)直接控制生物多樣性，對(duì)147個(gè)草地進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，草地生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性影響著草地短期和長(zhǎng)期的生產(chǎn)率及發(fā)展[4]。一些研究者指出隨著有機(jī)質(zhì)的施入和化學(xué)肥料的減少，土壤微生物生物量和微生物活性都明顯增加[5]。秸稈覆蓋與土壤微生物之間作用是相互促進(jìn)相互影響的，一方面秸稈覆蓋增加了土壤微生物生物量，提高微生物的活性[6]，另一方面土壤微生物生物量及活性的提高也會(huì)加快秸稈的腐解[7]。

傳統(tǒng)平板培養(yǎng)分離方法可分離出的微生物種類只占土壤微生物種類總數(shù)的0.1%—1%[8]。應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)可以有效地避免在傳統(tǒng)菌落培養(yǎng)分離過(guò)程由于微生態(tài)生境無(wú)法復(fù)制而造成的大量微生物多樣性的丟失，能夠更加全面而可靠的反映土壤微生物的組成情況，故其在微生物群落多樣性研究中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[9]。固氮細(xì)菌是生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的功能菌群，它在土壤氮素循環(huán)發(fā)揮著不可取代的作用[10]。目前有關(guān)秸稈還田條件下配合化肥使用對(duì)土壤微生物量和特殊生理類群微生物群落結(jié)果影響的研究還不多，關(guān)于秸稈還田下施用不同肥料對(duì)四川灰棕沖積水稻土微生物量及固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響的研究更無(wú)報(bào)道。本研究將應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究秸稈還田下不同施肥土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)，并對(duì)土壤中的主要固氮菌群進(jìn)行測(cè)序分析，從微生物角度了解秸稈還田土壤生態(tài)狀況，為秸稈還田與合理施肥、水分管理、保護(hù)土壤微生物等方面的工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)處理

試驗(yàn)土壤采集于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所于2002年建立在四川省廣漢市西高鎮(zhèn)的試驗(yàn)基地。該地為亞熱帶濕潤(rùn)氣候，年均氣溫16.3℃,積溫5980.4℃,降水量為890.8mm,日照時(shí)數(shù)為1229.2h,無(wú)霜期達(dá)281d。試驗(yàn)開(kāi)始于2004年10月，作物輪作為小麥水稻，一年兩熟。土壤為灰棕沖積水稻土，試驗(yàn)前的土壤基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。試驗(yàn)采取完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方案，5個(gè)處理：N150P60K90(CK，無(wú)覆蓋)，秸稈覆蓋+N90P60K90(SNL)，秸稈覆蓋+N150P60K90(SCK)，秸稈覆蓋+N150P60K0(SNP)和秸稈覆蓋+N150P0K90(SNK)，3次重復(fù)，小區(qū)面積為3m×4m。試驗(yàn)小區(qū)四周為20cm高田埂，重復(fù)之間有排水溝。各處理肥料用量分別為，氮肥(N，尿素) 90、150 kg/hm2；磷肥(P2O5，磷酸一銨) 0、60 kg/ hm2；鉀肥(K2O，氯化鉀) 0、90 kg/hm2。每季作物收獲后，秸稈全部均勻覆蓋于原試驗(yàn)小區(qū)，連續(xù)覆蓋免耕。小麥和水稻施肥時(shí)間和比例分別為，氮肥30%作底肥施用，70%作分蘗肥施用；磷肥全部作底肥施用；鉀肥50%作底肥，50%作分蘗肥。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

1.2 取樣方法

于2009年7月水稻生長(zhǎng)旺盛期，在田間采用“梅花型”布點(diǎn)取樣，取樣深度分別為0—10cm(在處理代碼后加T下標(biāo))和10—20cm(在處理代碼后加s下標(biāo))。將每一小區(qū)內(nèi)同一取樣點(diǎn)中相同深度土壤混勻，用無(wú)菌PET樹(shù)脂袋封裝帶回實(shí)驗(yàn)室。立即進(jìn)行土壤微生物數(shù)量分析和DNA的提取。另取一部分放于室內(nèi)風(fēng)干，研細(xì)過(guò)2 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)的分析。其它放在-20℃的冰箱里保存以備后續(xù)分析。

1.3 土壤微生物生物量的測(cè)定。

土壤微生物生物量土壤微生物生物量碳(MBC)、微生物量氮(MBN)的測(cè)定采用氯仿熏蒸法[11]。

1.4 土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的PCR-DGGE分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

1.4.1主要儀器和試劑DGGE所用儀器the D-code TM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Co)。采取巢式一步PCR擴(kuò)增nifH基因，巢式一輪引物為FGPH19和PolR，巢式第二輪引物為AQER和PolF-GC。(引物均由Invitrogen英杰生命技術(shù)公司合成)，具體引物序列參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。切膠純化試劑盒(TaKaRa，大連寶生物)純化。

1.4.2土壤微生物總DNA提取 采用土壤總DNA提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)，稱取0.5g于20℃保存的土樣，按試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取，在0. 8%的瓊脂糖凝膠中對(duì)提取的DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.4.3固氮菌nif-H基因的PCR擴(kuò)增采用Nested-PCR程序。

第一次PCR 所用引物為固氮菌nif-H基因的引物FGPH 19和Po1R，反應(yīng)體系為：PCR Master Mix (Tiangen Biotech, Bejing) 25L，每種引物0.5μL (20pmol/μL)，0.5μL 10倍稀釋的土壤總DNA提取液，加ddH2O至反應(yīng)終體積50μL。為減少擴(kuò)增過(guò)程中的非特異性產(chǎn)物，采用Touch-down PCR程序，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃ 1min，65—55℃ 50s (每個(gè)循環(huán)溫度降低0.5℃，72℃ 1.30min，20個(gè)循環(huán)，然后在其它條件不變的情況下，在55℃的退火溫度下繼續(xù)擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min，最后于4℃恒定保存。

第二次PCR 第一次PCR產(chǎn)物1∶10稀釋后作為二次PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行，引物為AQER和PolF-GC，反應(yīng)的體系為：10×PCR buffer緩沖液5μL, MgCl2(25mmol/μL) 3μL, dNTP(2.5mmol/μL) 1μL, PolF-GC (20pmol/μL) 0.5μL, AQER(20pmol/μL) 0.5μL, Taq DNA聚合酶(5u/μL) (Tiangen Biotech, Bejing)0.5μL，模板DNA1μL，加ddH2O至終體積50μL。反應(yīng)程序是在第一輪PCR的基礎(chǔ)上，退火溫度變?yōu)樵谇?0個(gè)循環(huán)為63—53℃，接下來(lái)的后15個(gè)循環(huán)的退火溫度為53℃，其它步驟與第一輪PCR反應(yīng)相同。

1.4.4 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

取第一次PCR產(chǎn)物15μL進(jìn)行DGGE分析，變性劑梯度范圍為20%—50%，自配的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8% (100%的變性劑為尿素7 mol/L和40%的去離子甲酰胺)。在1×TAE緩沖液中，50V電壓進(jìn)膠30 min，然后在150V 60℃緩沖液中電泳6h。電泳后采用銀染法進(jìn)行染色。然后用數(shù)碼相機(jī)拍照。DGGE指紋圖譜分析借助于Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)(Quantity One Bio-Rad, USA)分析樣品電泳條帶。

在圖像處理過(guò)程中，在DGGE電泳圖譜上有一些肉眼可見(jiàn)、但被軟件忽略掉的細(xì)小條帶進(jìn)行手動(dòng)添加，條帶的密度由該軟件自動(dòng)算出。

1.4.5 DGGE條帶的切割、克隆與測(cè)序

從DGGE凝膠上仔細(xì)切下有用的DGGE條帶裝于PCR反應(yīng)管中，用50μL無(wú)菌水反復(fù)沖洗3次后，加人20μL無(wú)菌水在4℃冰箱過(guò)夜。次日12000g離心5 min，收集上清液。以此作為模板進(jìn)行下一步的PCR擴(kuò)增，用引物AQER和PolF，進(jìn)行nif-H基因PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序同1.4.3中第一次PCR反應(yīng)。將上述PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體(Takara, 大連)上，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上選擇具有氨芐青霉素抗性的白色轉(zhuǎn)化子。采用T載體通用引物M13F, M13R進(jìn)行菌落PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否為陽(yáng)性克隆。測(cè)序工作由北京華大基因科技有限公司完成。

1.4.6 固氮基因nif-H序列分析

所得序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，并用BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，獲得與本實(shí)驗(yàn)所得序列相似性最高的序列。將這些相似性較高序列與本實(shí)驗(yàn)獲得的固氮基因nif-H序列一起，使用Clustal X1.83工具進(jìn)行多序列比對(duì)。然后使用MEGA軟件中的Kimura雙參數(shù)修正模型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Quantity One分析軟件分析得到相似性指數(shù)；以Shannon-Wiener指數(shù)反映固氮菌多樣性，香濃指數(shù)計(jì)算方法采用Eichner等[13]和Hedrick等[14]的方法；數(shù)據(jù)處理用Microsoft Excel 2000進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)與顯著性檢測(cè)利用SPSS11.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈覆蓋與不同施肥量對(duì)土壤微生物生物量碳、氮的影響

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物生物量的變化受到多種因素的影響如環(huán)境條件、施肥管理等，同時(shí)它們能夠靈敏地反映環(huán)境因子的變化，故常被用于土壤質(zhì)量生物學(xué)的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[15]。本研究中由于覆蓋秸稈和不同的施肥處理，導(dǎo)致土壤微生物利用的碳源數(shù)量、方式發(fā)生變化，從而使不同處理的土壤微生物生物量碳、氮表現(xiàn)出差異。供試土壤微生物生物量碳的變化范圍介于156.97—229.37mg/kg，微生物生物量氮的變化則介于21.87—35.85mg/kg，最低值均是沒(méi)有覆蓋秸稈的對(duì)照組的下層(10—20cm)土樣。SCKT與CKT處理的微生物生物量碳、氮差異顯著說(shuō)明覆蓋秸稈配施定量的氮磷鉀肥能夠使土壤微生物量碳、氮有明顯的提高。處理SCKT的微生物生物量碳、氮明顯高于SNLT，說(shuō)明秸稈覆蓋還田后只有當(dāng)?shù)爻渥銜r(shí)微生物才更容易繁殖。SNPT處理的微生物量碳、氮明顯低于SCKT，表明秸稈覆蓋還田配施相同的氮肥磷肥，但不施鉀肥不利于微生物生長(zhǎng)。處理SNKT微生物量碳顯著低于處理SCKT，而其微生物量氮雖也較低但卻沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明磷肥對(duì)于土壤微生物生物量碳、氮的影響不相同。同時(shí)說(shuō)明磷對(duì)于微生物的代謝具有重要的作用[16]。不同處理的下層土壤之間的差異與上層相似，且同一處理的上下層土壤的微生物生物量碳有顯著性差異，而微生物生物量氮均沒(méi)有顯著性差異。

土壤微生物生物量碳氮比(SMBC/SMBN)可反映微生物群落結(jié)構(gòu)信息，其顯著的變化表明微生物群落結(jié)構(gòu)變化直接影響微生物量的高低[17]。一般情況下細(xì)菌的碳氮比在5∶1左右。Petra Marschnera等[18]認(rèn)為土壤有機(jī)碳的含量和碳氮比能夠顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。不同處理間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性或多樣性變化主要是由于秸稈還田下不同施肥土壤的微域生境的改變所致，這種改變影響了土壤生境對(duì)多種微生物的適宜性。從表2看出，微生物生物量碳氮比的范圍5.52—7.26之間。同一層土樣不同處理的微生物碳氮比并沒(méi)有差異，同一處理的上層土壤與下層之間也沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明秸稈還田為微生物提供了充足的碳源，配施適量氮磷鉀肥增加了土壤養(yǎng)分，但是對(duì)土壤微生物生物量碳、氮的影響卻不相同，這可能是因?yàn)閺?fù)雜的環(huán)境因素對(duì)微生物有著多方面的影響。只有微生物碳氮比合適，且具有較高有效利用性，才能促進(jìn)微生物繁殖，從而增加土壤微生物生物量。

2.2 DGGE圖譜分析

固氮菌被認(rèn)為是土壤氮素循環(huán)中固氮環(huán)節(jié)不可或缺的重要成員。對(duì)固氮菌群落結(jié)構(gòu)和與固氮相關(guān)的種群動(dòng)態(tài)研究對(duì)于人們了解不同環(huán)境下的生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程十分重要。許多研究試圖通過(guò)不同的分離技術(shù)去研究土壤中具有固氮功能的固氮菌，但是對(duì)大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，細(xì)菌中不可培養(yǎng)部分占了總數(shù)的絕大多數(shù)。通過(guò)靶定固氮酶編碼基因nifH的PCR擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析，為深入了解固氮菌種群提供了很好的途徑[22]。

表2 秸稈還田下不同施肥處理的土壤微生物生物量碳氮

*CK為無(wú)秸稈覆蓋處理(N10P4K6), SNL為秸稈覆蓋+N6P4K6(低量氮肥)，SCK為秸稈覆蓋+N10P4K6，SNP為秸稈覆蓋+N10P4K0，SNK為秸稈覆蓋+N10P0K6，處理代碼的下標(biāo)T表示0—10cm土層，S表示10—20cm土層；表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；表中同列相同小寫(xiě)字母表示P≥0.05水平無(wú)顯著性差異

圖1 土壤固氮菌nifH基因的PCR-DGGE圖譜Fig.1 PCR-DGGE profiles of soil microbial nifH genes條帶近緣菌株依次為Closest relatives in turn：1. Azospirillum brasilense strain AWB12 (GQ161239.1,90%); 2. Uncultured soil bacterium clone T01(EU331520.1, 92%); 3. Uncultured bacterium clone KW-B4(HQ335637.1,96%); 4. Uncultured bacterium clone BNnif4 (HQ190124.1, 96%); 5. Uncultured bacterium clone U1C_12(DQ520301.1,97%); 6. Pseudacidovorax sp ptl-2(GQ249664.1, 94%); 7. Azospira oryzae strain(U97115.2,90%); 8. Uncultured bacterium clone(DQ140703.1,88%); 9. Uncultured bacterium clone pPS204 (FJ381614.1,95%); 10. Uncultured Burkholderia sp isolate DGGE(HM565855.1,94%); 11. Uncultured bacterium isolate DGGE (GU097344,95%); 12. Uncultured bacterium clone BNnif22 (HQ190133.1,95%); 13. Uncultured bacterium clone BNnif17 (HQ190131.1, 98%); 14. Ideonella dechloratans (EU542578.1,93%)

土壤中固氮酶編碼基因nifH的擴(kuò)增片段通過(guò)DGGE被分成了許多條帶，不同的條帶代表不同的固氮細(xì)菌及基因片段。結(jié)果如圖1，從圖中我們可以初步看出：供試土壤在DGGE圖譜中電泳條帶數(shù)目、強(qiáng)度和遷移率均存在一定程度的差異，充分顯示了固氮細(xì)菌的多樣性。每個(gè)泳道中條帶的亮度反映出固氮菌相對(duì)生物量的多少，電泳條帶的多少可以直觀地反映樣品中固氮菌群落的遺傳多樣性。從指紋圖譜可以看出每個(gè)樣品均可分離到10到18條不等的條帶。條帶數(shù)目最少的是CKS處理，條帶數(shù)目最多的是SCKT處理，表明配施足夠的氮磷鉀肥+秸稈覆蓋能夠維持土樣營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充足，防止植物與微生物爭(zhēng)氮，更有利于固氮細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。圖譜中不同土壤間有一些共同的條帶如條帶1、4，說(shuō)明供試土壤間存在共同的固氮菌類群，但是這些共有條帶的亮度不相同，說(shuō)明土壤固氮菌的數(shù)量有一定的改變。

2.3 土壤固氮菌多樣性指數(shù)

根據(jù)電泳圖譜中每個(gè)條帶的信息，對(duì)不同處理土壤中固氮菌多樣性指數(shù)(H)、豐度(S)和均勻度(EH)等指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，多樣性指數(shù)和豐富度最高的處理是SCKT，其值分別為2.86和18.00；而最低的是CKS，這兩個(gè)值僅為2.38和10.33。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后得知，處理SCKT和CKT多樣性指數(shù)及豐富度均有顯著性差異，說(shuō)明覆蓋秸稈后配施氮磷鉀肥能夠明顯的提高土壤固氮菌的多樣性。處理SCKT的多樣性指數(shù)和豐富度明顯大于SNLS說(shuō)明覆蓋秸稈配施相同量的磷鉀肥，氮肥施用高的土壤固氮菌多樣性指數(shù)更大。土壤生境碳氮比需要維持在一定的水平，由于配施秸稈后土壤碳素增加，只有當(dāng)配施足夠的氮才能防止微生物與植物爭(zhēng)氮，更有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖[2]。SNPT處理的多樣性指數(shù)和豐富度明顯低于SCKT處理，表明秸稈覆蓋后只配施氮磷肥、缺少鉀肥不利于固氮菌的生長(zhǎng)。SNKT處理的多樣性指數(shù)和豐富度低于SCKT處理但沒(méi)有明顯差異，表明磷肥對(duì)于固氮菌多樣性指數(shù)有一定影響但是并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。從表3可以看出，同一個(gè)處理的上下層土壤多樣性指數(shù)及豐富度均沒(méi)有顯著差異。同一處理的上層或下層土壤固氮菌的均勻度除了處理SCKT和SCKS有差異外，其余上下層處理均沒(méi)有顯著差異。不同處理的上層土壤固氮菌的均勻度中處理SCKT只與處理SNPT有顯著性差異，不同處理的下層土壤中處理SCKs與處理SNPs也有顯著性差異，說(shuō)明鉀肥對(duì)于固氮細(xì)菌均勻度也有一定的影響。

表3 秸稈還田下不同施肥處理土壤固氮基因nifH多樣性指數(shù)

2.4 土壤固氮菌群落相似性分析

進(jìn)一步利用Quantity One軟件(Bio-Rad)對(duì)DGGE圖譜的條帶數(shù)和亮度進(jìn)行數(shù)字化處理，并依此為據(jù)進(jìn)行聚類分析，得到各處理間的聚類分析結(jié)果(圖2) 。10個(gè)處理聚類為三大族群， CKT、CKS為一種族群；SNLT、SNLS、SNPT、SNPS為一個(gè)族群；SCKT、SCKS、SNKT、SNKS為第三族群。通過(guò)DGGE聚類圖可以看出，相同的處理的上下層土壤聚到了一起，不同處理聚在了不同的族群里，說(shuō)明秸稈覆蓋和不同的施肥方式都導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)差異，從而導(dǎo)致不同處理間的土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響不一致。從圖中可以看出，只施肥而不覆蓋秸稈的處理單獨(dú)聚成了一族，說(shuō)明覆蓋秸稈使土壤固氮菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。

圖2 DGGE圖譜聚類分析Fig.2 Cluster analysis of DGGE banding patterns

2.5 DGGE條帶測(cè)序分析

根據(jù)土壤固氮菌DGGE圖譜中出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)和特殊共有條帶進(jìn)行測(cè)序，將所得序列輸入NCBI網(wǎng)站將同源性較高的序列下載，通過(guò)Clustal X1.83, Mega Soft等軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖3。從系統(tǒng)樹(shù)可見(jiàn)該固氮菌群有豐富的菌種組成多樣性，14個(gè)條帶的近緣種大部分為非培養(yǎng)細(xì)菌nifH基因片段，主要優(yōu)勢(shì)菌群其歸屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)的β-變形菌綱(Betaproteobacteria)非培養(yǎng)伯克氏菌屬、假食酸菌屬(Pseudacidovorax)、Azospira屬、Ideonella屬。14個(gè)條帶分屬于4個(gè)主要的簇，其中第一簇中的band 10、band 11、band 12、band 13與銅礦荒地的非培養(yǎng)伯克氏菌屬固氮細(xì)菌HM565855.1 十分相似，band 3與荷蘭Kollumerwaard土壤非培養(yǎng)細(xì)菌HQ335637.1十分相似、band 14與Ideonelladechloratans菌株EU542578.1相似性為94%，第二簇中band 2、band 5、band 6 與假食酸菌屬(Pseudacidovorax)菌株聚在一起，band 1、band 4、band 7與Azospira屬菌株聚為第三簇，band 8、band 9與其它序列差異較大單獨(dú)成簇，其為未確定歸屬的固氮細(xì)菌。

圖3 DGGE切膠條帶的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，序列的GenBank登錄號(hào)列于括號(hào)中，尺長(zhǎng)度為5%的核苷酸置換率Fig.3 Phylogenetic tree of sequences from DGGE bands. Numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank. The scale bar: 5% sequence divergence

3 討論

3.1秸稈還田能有效改善土壤物理性結(jié)構(gòu)，改善各類土壤細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)條件與提高細(xì)菌活性，有機(jī)肥與秸稈還田措施均可以提高不同功能土壤微生物類群的活性，有效的提高了氮肥的利用效率，使農(nóng)作物產(chǎn)量得到增加[19]。微生物生物量碳、氮被認(rèn)為是土壤活性養(yǎng)分的儲(chǔ)存庫(kù)，是植物生長(zhǎng)可利用養(yǎng)分的重要來(lái)源[11]。土壤微生物生物量碳、氮是土壤微生物軀體中所固定的碳素和氮素，其含量的多少?zèng)Q定于土壤中微生物的數(shù)量，是土壤微生物對(duì)碳素、氮素同化與固持作用這種動(dòng)態(tài)過(guò)程的綜合反映。Nie Jun[20]等研究表明秸稈覆蓋提高了微生物生物量碳和微生物生物量氮，與只施化肥田塊相比，分別提高了12.66%和15.07%；與對(duì)照相比，分別提高了7.76%和31.42%。

本試驗(yàn)表明秸稈覆蓋還田配施適量氮磷鉀肥土壤微生物生物量碳氮的含量明顯高于對(duì)照處理，說(shuō)明秸稈還田為微生物生長(zhǎng)和繁殖提供了大量的碳源和能源，同時(shí)施用的氮肥又為微生物的生長(zhǎng)提供了較多的氮源，刺激了微生物的生長(zhǎng)。在秸稈覆蓋的處理中SCKT、SCKS分別高于SNLT、SNLS，即施氮肥較高的處理具有更高的微生物生物量碳、氮值。秸稈還田后，隨著施氮量的增加，提供給微生物的氮素增多，促進(jìn)了微生物的繁殖，加快了秸稈腐解。處理SNPT、SNKT的微生物生物量碳氮低于SCKT，處理SNPS、SNKS的微生物生物量碳氮低于SCKS。說(shuō)明秸稈覆蓋后需同時(shí)配施適量氮磷鉀才能更好地為微生物的生長(zhǎng)提供更全面的能源物質(zhì)。秸稈覆蓋下不同施肥配比對(duì)表層土壤影響更大，并隨著土層加深而減少。其原因是表層土壤能較好地與外界進(jìn)行物質(zhì)與能量交換，進(jìn)入土壤的有機(jī)物質(zhì)最先聚集于表層，養(yǎng)分條件好，土壤微生物活動(dòng)旺盛，有利于微生物的繁殖。本試驗(yàn)同一處理的上下層土壤的微生物生物量碳有顯著性差異，而微生物量氮均沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明本研究中20cm表土層內(nèi)微生物生物量碳氮均受到秸稈覆蓋及施肥的影響，但是影響的程度和方式卻不相同。

3.2PCR-DGGE技術(shù)是從微生物基因多樣性的角度研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的方法，近年來(lái)己經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[21]。與純培養(yǎng)相比，PCR克隆、RFLP分析等非培養(yǎng)方法被用于研究不同環(huán)境下nifH基因的組成和多樣性，更有利于對(duì)固氮生物進(jìn)行完整和深入的探索和研究。采用PCR-DGGE方法對(duì)秸稈覆蓋還田下不同施肥處理的土壤微生物nifH基因多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行研究，從指紋圖譜我們可以看出不同處理土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)有一定的差異。Juraeva等研究發(fā)現(xiàn)，土壤總氮含量能夠影響固氮微生物的分布[22]。Keeling等研究表明，土壤碳氮比例影響著土壤固氮微生物的活性[23]。因此，土壤理化性質(zhì)的差異可以影響固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)。對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析和多樣性統(tǒng)計(jì)表明同層間SCKT、SCKS處理具有最高的多樣性指數(shù)及豐富度，而僅CKT、CKS對(duì)照組這兩個(gè)值最小。結(jié)果說(shuō)明秸稈覆蓋還田配合不同施肥措施改變了土壤的營(yíng)養(yǎng)狀況，改善土壤的生物學(xué)特征，導(dǎo)致土壤固氮微生物多樣性發(fā)生變化。Baumann等研究也指出植物殘留物能夠影響微生物的呼吸和微生物群落結(jié)構(gòu)[24]。從樣品DGGE優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序結(jié)果可以看出，這些條帶中最多的是非培養(yǎng)固氮細(xì)菌，其余對(duì)應(yīng)的同源性最高的微生物分別屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)的非培養(yǎng)伯克氏菌屬、假食酸菌屬(Pseudacidovorax)、Azospira屬以及Ideonella屬。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)土壤中固氮菌遺傳多樣性較為豐富。Bodelier等也證明了像水稻這樣的淹水作物的根際上壤中氧量較低，特別適合于進(jìn)行生物固氮[25]。本研究運(yùn)用PCR-DGGE方法得到的這些固氮細(xì)菌還未被培養(yǎng)或不可培養(yǎng)，故很難鑒定它們?cè)诟魍寥乐械纳鷳B(tài)功能，要具體了解這些優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)構(gòu)與功能，還需要做更全面細(xì)致的研究。

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Effectofdifferentfertilizercombinationsandstrawreturnonmicrobialbiomassandnitrogen-fixingbacteriacommunityinapaddysoil

LIU Xiaoqian1, TU Shihua2, SUN Xifa2, GU Yunfu1, ZHANG Xianqin1, ZHANG Xiaoping1,*

1CollegeofResourcesandEnvironment,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China2SoilandFertilizerInstitute,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Chengdu610066,China

Chloroform fumigation and denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) were employed to study the influence of different fertilizer treatments with crop residue return on microbial biomass and nitrogen-fixing bacteria community in a gray brown alluvial paddy soil at soil depth of 0—10 cm and 10—20cm. Results show that soil microbial biomass carbon (SMB-C), microbial biomass nitrogen (SMB-N) and diversity of nitrogen-fixing bacteria decreased with soil depths. The control treatment with straw removal had the lowest amounts of SMB-C and SMB-N. Among the treatments receiving straw return, the quantity of SMB-C and SMB-N in the treatments with low nitrogen rate and omitting was significantly lower than the full rate NPK treatment. Omission of phosphate on the basis of NPK nonsignificantly reduced the SMB-N compared to the NPK treatment. It shows that straw mulching with addition of adequate NPK fertilizers can significantly increase the SMB-C and SMB-N. The diversity indices of DGGE profiles indicate that the treatment with adequate NPK had the most abundant nitrogen-fixing bacterial diversity. According to UPGMA cluster analysis, dendrogram of the 10 treatments were different, and the micro-organisms at the 0—10cm and 10—20cm in the control treatment differed from all the other treatments and stood alone in a separate group. DGGE bands sequencing further revealed that the 14 closely related species were largely uncultured bacterianifHgene fragment with the predominant community falling in the class of Proteobacteria in Betaproteobacteria. Application of PCR-DGGE can well interpret the community structure characteristics of the nitrogen-fixing bacteria molecules in the gray-brown alluvial paddy soil with straw return and different fertilizer treatments.

straw return; gray-brown alluvial paddy soil; microbial biomass; PCR-DGGE; nitrogen-fixing bacteria community

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)資助(201003016)

2012- 05- 29;

2012- 10- 26

*通訊作者Corresponding author.E-mail: luwenru@mail.caas.net.cn

10.5846/stxb201205290788

劉驍蒨，涂仕華，孫錫發(fā)，辜運(yùn)富，張先琴，張小平.秸稈還田與施肥對(duì)稻田土壤微生物生物量及固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(17):5210- 5218.

Liu X Q, Tu S H, Sun X F, Gu Y F, Zhang X Q, Zhang X P.Effect of different fertilizer combinations and straw return on microbial biomass and nitrogen-fixing bacteria community in a paddy soil.Acta Ecologica Sinica,2013,33(17):5210- 5218.