王 彬，沈 嵐，從文娟，朱云云，王 強，馮 怡

(上海中醫(yī)藥大學(xué)1.中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程中心、2.中藥學(xué)院，上海 201203)

甲狀腺功能亢進癥(hyperthyroidism，簡稱甲亢)是由于甲狀腺激素增多，興奮機體各系統(tǒng)，出現(xiàn)物質(zhì)、能量代謝亢進現(xiàn)象。常見癥狀為多食易饑、血糖升高、體重減輕、心動過速、急躁、乏力等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療方法是通過抑制和破壞甲狀腺使甲狀腺激素合成減少而達到治療的目的。然而，這種治療方法不能從病因治療，且易發(fā)生不良反應(yīng)，特別是對于機體極為虧虛的情況，更需要滋陰補虛藥物的干預(yù)。六味地黃丸在滋陰補虛、調(diào)節(jié)免疫力等方面發(fā)揮明顯的優(yōu)勢，由熟地黃、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉、山茱萸經(jīng)加工制成。有研究表明，它能夠降低血糖、增加肝糖元含量［1］。地黃中的地黃苷D調(diào)節(jié)機體糖代謝，起到滋陰補血和降血糖的作用;芍藥苷對補血及抗心、腦血管損傷有一定的作用，改善能量代謝障礙;六味地黃丸中的多糖CA4［2-3］還能刺激脾分泌IgG和抗體細(xì)胞，具有免疫功效。

代謝組學(xué)是以“整體性研究”和“動態(tài)性研究”為特點的一門新學(xué)科［4］，與中醫(yī)藥的整體動態(tài)性原則具有很大的趨同性，因此被認(rèn)為是最有可能對中醫(yī)藥研究有所突破的工具［5-6］，代謝組學(xué)技術(shù)在某些病的診治中具有良好的應(yīng)用前景，同時也為中醫(yī)藥的整體評價和研究提供了可能［7］。

本文采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)分析甲亢模型大鼠、正常對照大鼠、六味地黃丸給藥組大鼠的血樣成分譜變化，結(jié)合模式識別方法分類，尋找并解釋標(biāo)記物歸屬，聯(lián)系機體物質(zhì)和能量代謝的代謝通路和代謝網(wǎng)絡(luò)［8-9］，進一步闡釋甲亢模型的產(chǎn)生機制和六味地黃丸的干預(yù)機制。這種方法為全面建立一種基于代謝組學(xué)的手段來診斷甲亢的病因和評價六味地黃丸治療作用，提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 六味地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號:1074785);L-左旋甲狀腺素鈉(L-Thyroxine Sodium)(阿拉丁試劑，規(guī)格:1 g/支，批號:1100477)。LC-MS級乙腈購自J.T.Baker公司(J.T.Baker Chemical Co.，USA)，HPLC級甲醇購自 Merck公司(Darmstadt，Germany)，甲酸購自 Fluka公司(Buchs，Switzerland)。其它試劑均為市售分析純。超純水(18.2 MΩ)由本實驗室Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，F(xiàn)rance)制備。

1.2 實驗動物 19只 ♂ SD大鼠(140～160 g)，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物房，室溫(24±0.8)℃，相對濕度60%，光照采用12 h明暗交替。

1.3 實驗儀器 Waters AcquityTM超高效液相色譜系統(tǒng)(Waters，Millford，MA)，配備高壓二元梯度泵、可控溫自動進樣器(4℃)和二極管陣列檢測器;質(zhì)譜檢測采用Waters Premier TOF飛行時間質(zhì)譜儀(Waters，Millford，MA)，配有 ESI電離源接口和Lock-spray接口。FA1004N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);SK52004超聲清洗裝置(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);TGL-16B高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4 造模及取樣 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，后4天連續(xù)灌胃生理鹽水，使習(xí)慣灌胃及適應(yīng)環(huán)境。后隨機分成2組:模型組12只，按35 μg·(100 g)-1皮下注射L-左旋甲狀腺素鈉續(xù)造模1周［10］;另7只作為正常對照組，給予適量的生理鹽水對照。

將造模成功的12只大鼠，隨機分為2組，每組6只，分別為給藥組和模型組。實驗期間，給藥組按劑量4.7 g·kg-1給以六味地黃丸溶液;模型組大鼠灌胃給予等體積的生理鹽水。每天上午7:00～8:00給藥，1日1次，連續(xù)給藥3周。3周后，各大鼠腹主動脈取血，離心得血清。

1.5 血清樣品處理 取凍融后的血清100 μl，加入400 μl甲醇，渦旋2 min，充分混勻，離心(13 000 r·min-1，4℃，15 min)沉淀蛋白，取上清液。取200 μl加入10 μl內(nèi)標(biāo)(1 g·ml-1氯苯丙氨酸水溶液)，渦旋(3 000 r·min-1，2 min)，取上清液于玻璃進樣小瓶，備用。

1.6UPLC/QTOF-MS分析 色譜質(zhì)譜分析采用Waters Acquity UPLC超效液相色譜儀和Q-TOF質(zhì)譜聯(lián)用儀，電噴霧(ESI)離子源。色譜條件:色譜柱采用Waters公司AcquityTM-BEH C18反相分析柱(100×2.1 mm，1.7 μm，Waters，MA，USA)，流動相為0.1%甲酸水溶液-1% 乙腈(A)和純乙腈-0.1% 甲酸-1% 水(B)，流速0.4 ml·min-1，自動進樣器溫度設(shè)定4℃，氮氣為載氣。采用梯度洗脫方式，設(shè)置如下:血清正離子:0～4 min(1% ～30%B)，4～6 min(30% ～80%B)，6～8 min(80% ～90%B)，8～9 min(90% ～100%B)，9～11 min(100%B)，11～13 min(100% ～1%B);血清負(fù)離子:0～1 min(1～20%B)，1～3 min(20～70%B)，3～8 min(70～85%B)，8～9 min(85～100%B)，9-11 min(100%B)，11-13 min(100-1%B)。質(zhì)譜條件:質(zhì)譜分析檢測參數(shù):脫溶劑氣流量650 L·min-1，脫溶劑氣溫度350℃，錐孔氣流量50 L·h-1，離子源溫度110℃，毛細(xì)管電壓3000 V，正離子模式采用錐孔電壓35 V、負(fù)離子模式采用錐孔電壓55 V，質(zhì)量校準(zhǔn)選擇“DRE”模式，取LEA“A+1”和“A-1”同位素峰(正離子模式556.2771 m·z-1)、(負(fù)離子模式554.2615 m·z-1)作為質(zhì)量校準(zhǔn)峰。質(zhì)譜圖平均掃描速率設(shè)為0.28 s～0.02 s，質(zhì)量掃描范圍50～1000 m·z-1，每次進樣5 μL，樣品運行按照隨機順序進行。

1.7 方法學(xué)考察 取空白血樣連續(xù)進樣6次，考察正、負(fù)離子下總離子流色譜圖中的8個主要指紋峰的保留時間(Retention time)和峰強度(Intensity)的變化情況。結(jié)果表明代謝指紋譜中主要指紋峰的保留時間RSD均小于0.3%，峰面積RSD均小于5.0%。因此，該方法穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性良好，可以滿足后續(xù)代謝組學(xué)分析的要求。

1.8 數(shù)據(jù)處理 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理采用Waters公司Masslynx軟件(Waters，MA，USA)進行色譜峰自動識別、峰匹配、峰對齊、峰提取和歸一化處理(主要參數(shù)見Tab 1)，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P(11.5 demo version，Umetrics AB，Ume，Sweden)進行 PLS-DA數(shù)據(jù)分析。

Tab 1 The parameter sets for identification of chromatographic peak

2 結(jié)果

2.1 動物特征和變化 造模一周后，模型組大鼠出現(xiàn)毛色黃暗而不順、脾氣暴躁、飲水量增多、鼠籠潮濕、便多、心率加速等癥狀，模型組大鼠相對空白組大鼠的體重降低、體溫升高(如Tab 2所示)，預(yù)示造模成功。服用六味地黃丸3周后，相對模型組，給藥組的大鼠的毛色柔順、便量減少、心率減緩;上述的脾氣暴躁、飲水量增多、鼠籠潮濕等癥狀也有所緩解;體重和體溫也趨于正常(如Tab 2所示)。

Tab 2 The different groups of body temperatureand body weight changes(n=6)

2.2 血清UPLC-QTOF-MS代謝指紋譜的構(gòu)建預(yù)實驗中，本研究采用少量樣本對實驗條件優(yōu)化，分別考察樣品在正負(fù)模式下的響應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正負(fù)模式下噪音和基質(zhì)效應(yīng)都較低，都可以提供豐富的信息，正離子模型檢測到的離子大都以［M-H］-和［M+COOH］-的形式出現(xiàn)，負(fù)離子模型檢測到的離子大都以［M+H］+和［M-COOH］+的形式出現(xiàn)。

由于樣品的成分復(fù)雜，對于許多化學(xué)性質(zhì)和極性差異較大的成分，采用常規(guī)線性梯度無法在短時間內(nèi)對其同時分離。在本實驗條件下，我們選擇了兩階線性梯度方式，既可保證這些物質(zhì)的有最佳的分離效果，又能提高分析速度。在流動相體系中加入甲酸，能使樣品中尤其是酸性化合物的色譜分離得到改善。色譜條件優(yōu)化重點考察了流速和柱溫對UPLC分離的影響，最終確定了上述的幾種液-質(zhì)聯(lián)用條件。以根據(jù)參數(shù)優(yōu)化后得到代表性的大鼠空白血清為例，展示UPLC-QTOF-MS代謝指紋譜，如Fig 1、2 所示。

Fig 1 The metabolic fingerprinting of normal rat serum at positive ion mode

2.3 不同組別代謝指紋圖譜差異 本研究采用SIMCA-P軟件對Masslynx軟件處理的正常對照組、模型組、六味地黃丸給藥組3組數(shù)據(jù)進行PLS-DA分析(如Fig 3、4所示)。從PLS-DA聚類score圖可以看出，3組都能達到很好的分離，且給藥組位于模型組和正常對照組的中間。以上結(jié)果說明正常對照組和模型組間內(nèi)源性代謝物的含量存在明顯差異，給予藥物后，異常代謝改善。代謝組學(xué)分析的結(jié)果更加直觀、明確、綜合反映了模型的誘導(dǎo)和六味地黃丸干預(yù)甲亢模型的優(yōu)勢。

Fig 2 The metabolic fingerprinting of normal rat serum at negative ion mode

Fig 3 The PLS-DA clustering score map of serum at positive ion for control group(n=7)，LDP-treated group(n=6)and model group(n=6)

Fig 4 The PLS-DA clustering score map of serum at negative ion for control group(n=7)，LDP-treated group(n=6)and model group(n=6)

Tab 3 Identification of potential biomarkers in serum

2.4 潛在生物標(biāo)志物的指認(rèn) 在代謝組學(xué)分析過程中，對潛在生物標(biāo)志物的指認(rèn)是一個非常重要的過程，也是代謝組學(xué)研究中的一個難點。采用PLSDA對數(shù)據(jù)進一步分析，VIP值越大對分組的貢獻也越大，利用VIP＞1再結(jié)合t檢驗，篩選出差異具有顯著性(P＜0.05)的化合物被認(rèn)為對模型有顯著貢獻。結(jié)果正離子模式找到15個具有明顯差異的化合物，負(fù)離子模式找到5個具有明顯差異的化合物(如Tab 3)。TOF-MS可以獲得的這些潛在生物標(biāo)記物的精確分子量，使用Waters公司的Masslynx軟件中的i-FIT功能，對所篩查到的具有顯著性差異的代謝物進行分析，計算可能的分子式。然后利用公共數(shù)據(jù)庫KEGG(http://www.genome.jp/kegg/ligand.html)和HMDB(http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/～aguo/www_hmdb_ca/HMDB/)等對化合物進一步鑒定［11］。

Tab 3中，相比較正常大鼠，甲亢模型大鼠機體內(nèi)的草酰乙酸(Oxalacetic acid)、磷酸二羥基丙酮(DHAP)、乙基葡糖苷酸(Ethyl glucuronide)、羥基犬尿氨酸(Hydroxykynurenine)、甘油三酯(TG，Triglycerides)、溶血磷脂(lysophospholipids)和膽固醇(cholesterol)呈明顯上調(diào)趨勢。此外，模型大鼠服用六味地黃丸治療一段時間后，其體內(nèi)的草酰乙酸(Oxalacetic acid)、磷酸二羥基丙酮(DHAP)、乙基葡糖苷酸(Ethyl glucuronide)發(fā)生明顯下調(diào)，同時，發(fā)現(xiàn)其中的磷酸二羥基丙酮(DHAP，Dihydroxyacetone phosphate)、乙基葡糖苷酸(Ethyl glucuronide)、甘油三酯(TG，Triglycerides)、卵磷脂(PC，phosphatidylcholine)、甘油二酯(DG，diacylglycerol)、磷脂酰肌醇(PI，phosphatidylinositol)等的代謝水平，逐漸接近正常狀態(tài)。這表明六味地黃丸對甲亢具有一定的治療作用。

3 討論

目前，關(guān)于六味地黃丸，大多研究集中在探討其治療腎陰虛的作用機制，鮮有關(guān)于六味地黃丸治療甲亢的機制研究的報道。王喜軍［12］采用 UPLCHDMS技術(shù)針對大鼠的尿液進行代謝組學(xué)研究，推測六味地黃丸可以改善腎陰虛機體的物質(zhì)和能量代謝;高崗［13］采用LC-TOF-MS研究了陰虛大鼠的血漿，僅推測其發(fā)病機制與脂質(zhì)代謝有關(guān)。由于血液作為生物體系統(tǒng)中最為重要的生物體液，其不僅擔(dān)負(fù)著生命系統(tǒng)中各種營養(yǎng)成分向不同組織、器官的實時補充和轉(zhuǎn)運的任務(wù)，還是機體輸出各種代謝產(chǎn)物的主要途徑。因此本文采用正、負(fù)2種不同的檢測模式，對甲亢大鼠服用六味地黃丸后的血清進行UPLC-QTOF-MS的分析，結(jié)合統(tǒng)計學(xué)分析和KEGG、HMDB數(shù)據(jù)庫研究，不僅可以闡明甲亢的誘發(fā)機制，還可以進一步解析六味地黃丸的治療作用研究。

在預(yù)實驗中，六味地黃丸給藥組采用低中高不同的劑量，其中低劑量組0.95 g·kg-1，相當(dāng)于人劑量的1倍;中劑量組4.7 g·kg-1，相當(dāng)于人劑量的5倍;高劑量組9.5 g·kg-1，相當(dāng)于人劑量的10倍。在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)低劑量組的效果不如中劑量明顯，而高劑量組的大鼠由于藥物濃度過大，影響胃腸的正常功能，出現(xiàn)機體消瘦、甚至出現(xiàn)大量死亡等現(xiàn)象。所以正式實驗中采用4.7 g·kg-1六味地黃丸藥量作為最佳的給藥劑量。

研究結(jié)果顯示模型組大鼠體內(nèi)草酰乙酸含量升高，推測三羧酸循環(huán)受阻;磷酸二羥基丙酮和乙基葡糖苷酸的含量均升高，乳酸含量降低，推測糖代謝出現(xiàn)紊亂;甘油三酯、溶血磷脂、膽固醇等含量呈現(xiàn)增加趨勢，推測脂質(zhì)代謝也發(fā)生了紊亂。糖類、脂類代謝水平及三羧酸循環(huán)反映機體內(nèi)物質(zhì)能量代謝情況［14］。在甲亢機體內(nèi)，造模藥物甲狀腺激素類興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)，代謝酶大量合成［15］，代謝加速，引起機體過耗，導(dǎo)致了全身機能減退，出現(xiàn)代謝紊亂。這與我們在實驗期間觀察到的大鼠毛色黃暗而不順、體重減輕、體溫升高、心率加速、脾氣暴躁、飲水量增多、鼠籠潮濕、便多等癥狀相吻合，說明采用L-左旋甲狀腺素鈉造甲亢陰虛的模型成功，也為準(zhǔn)確判斷六味地黃丸干預(yù)甲亢的效果奠定基礎(chǔ)。

模型動物給予六味地黃丸后，大部分關(guān)鍵標(biāo)志物的代謝水平可以回調(diào)接近正常狀態(tài)。給藥后大鼠體內(nèi)的草酰乙酸含量相對模型組的有所降低，推測三羧酸循環(huán)受阻的現(xiàn)象有所改善;磷酸二羥基丙酮和乙基葡糖苷酸的含量也相對模型組有所降低，乳酸含量升高，推測糖代謝紊亂也有所改善;甘油三酯、溶血磷脂、膽固醇等含量也有一定的調(diào)節(jié)回調(diào)正常，推測脂質(zhì)代謝紊亂也有改善。這提示我們從對機體代謝的調(diào)節(jié)角度而言，六味地黃丸對甲亢大鼠具有一定的修復(fù)作用。六味地黃丸中從糖代謝、酶活性等能量代謝和免疫調(diào)節(jié)等方面來改善機體，使機體調(diào)至正常，使機體趨向于正常。

［1］劉保林，溫文清，朱丹托.六味地黃湯及其組方對小鼠血糖和肝糖元的影響［J］.中國中藥雜志，1991，16(7):437-8.

［1］Liu B L，Wen W Q，Zhu D T.Effeet of liuweidihuang decoction and Its compositions on blood suger and glycogen in mice ［J］.China J Chin Mater Med，1991，16(7):437-8.

［2］齊春會，張永祥，喬善義.六味地黃多糖體外對正常及衰老小鼠脾細(xì)胞免疫功能的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，1999，15(2):157-60.

［2］Qi C H，Zhang Y X，Qiao S Y.Effects of polysaccharides from liuweidihuang decoction on the splenocyte immune functionin vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，1999，15(2):157-60.

［3］齊春會，付艷榮，張永祥.六味地黃多糖CA4-3對小鼠B細(xì)胞功能的作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2001，17(4):469-73.

［3］Qi C H，F(xiàn)u Y R，Zhang Y X.Effect of CA4-3，the acid polysaccharides isolated from Liuwei Dihuang Decoction，on the function of B lymphocytes in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2001，17(4):469-73.

［4］劉樹民，盧 芳，王喜軍，等.基于代謝組學(xué)的熱病證候模型評價方法研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(4):549-51.

［4］Liu S M，Lu F，Wang X J.Research on evaluation methods of the fever syndrome model based on metabonomics［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(4):549-51.

［5］Qiu J.Traditional medicine:A culture in the balance［J］.Nature，2007，448:126-8.

［6］Qiu J.Back to the future for Chinese herbal medicines［J］.Nat Rev Drug Discov，2007，6(7):506-7.

［7］從文娟，劉清飛，梁瓊麟，等.基于血清代謝組學(xué)的吡柔比星注射劑的累積毒性作用研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，25(9):1294-8.

［7］Cong W J，Liu Q F，Liang Q L.Serum metabolites of commerical pirarubicin injections［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，25(9):1294-8.

［8］夏建飛，王義明，羅國安.代謝組學(xué)研究策略與方法的新進展［J］. 分析化學(xué)，2009，37(1):136-43.

［8］Xia J F，Wang Y M，Luo G A.Recent trends in strategies and methodologies for metabonomics［J］.Chin J Analyt Chem，2009，37(1):136-43.

［9］Kell D B.Metabolomics and systems biology:making sense of the soup［J］.Curr Opin Microbiol，2004，7(3):296-307.

［10］郭 娟，陳長勛，李 欣.加減玉女煎抗甲狀腺機能亢進作用的研究［J］. 中國中藥雜志，2009，34(18):2369-72.

［10］Guo J，Chen C X，Li X.Experiment research of Jiajian Yunvjian granules on hyperthyroidism graves［J］.China J Chin Mater Med，2009，34(18):2369-72.

［11］Weckwerth W.Metabolomics in systems biology［J］.Annu Rev Plant Biol，2003，54:669-89.

［12］Wang P，Sun H，Lü H T.Thyroxine and reserpine-induced changes in metabolic profiles of rat urine and the therapeutic effect of Liu Wei Di Huang Wan detected by UPLC-HDMS ［J］.J Pharm Biomed Anal，2010，53(3):631-45.

［13］高 崗.腎虛證代謝組學(xué)及六味地黃湯的干預(yù)研究［D］.上海:上海第二軍醫(yī)大學(xué)，2009.

［13］Gao G.The intervention study of kidney deficiency metabolomics and the Liuweidihuang［D］.Shanghai:The second military medical university，2009.

［14］Buettner R，Parhofer K G，Woenckhaus M.Defining high-fat-diet rat models:metabolic and molecular effects of different fat types［J］.J Mol Endocrinol，2006，36(3):485-501.

［15］但漢雄.甲狀腺機能對肝臟藥物代謝酶的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，1996，12(6):569.

［15］Dan H X.Thyroid function to the influence of the liver drug metabolizing enzymes ［J］.Chin Pharmacol Bull，1996，12(6):569.