金濤，文國(guó)容，金海，陸遠(yuǎn)富，劉杰，3＊

（1.遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室及貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3.University of Kansas Medical Center，Kansas City，KS 66160，USA）

原發(fā)性肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤第5位。目前我國(guó)的發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，已成為嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康和生命的一大殺手。近年來有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與時(shí)辰節(jié)律也存在一定的關(guān)聯(lián)性。哺乳動(dòng)物的多種生理、生化行為都表現(xiàn)出一定的節(jié)律變化，并受到時(shí)鐘基因的調(diào)控。時(shí)鐘基因不僅參與正常組織基因的表達(dá)而且也通過對(duì)致癌基因、抑癌基因和內(nèi)分泌通路的影響，多方面參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［1］。國(guó)內(nèi)外常用二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）來誘導(dǎo)建立肝癌動(dòng)物模型［2］，以達(dá)到模擬人體肝癌病變過程。本文亦通過DEN誘導(dǎo)建立肝癌模型來檢測(cè)正常組織、癌組織、癌旁組織中時(shí)鐘基因的表達(dá)，進(jìn)一步探討時(shí)鐘基因在DEN誘導(dǎo)肝癌情況下的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）購自天津化學(xué)試劑研究所；Trizol購自TakaRa公司；High Capacity Reverse Transcriptase Kit購自Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA；Power SYBR Green PCR Master Mix購自Takara公司；美國(guó) BIO－RAD 熒光定量 PCR 儀，儀器編號(hào)：20050034；德國(guó)Eppendorf多功能梯度PCR儀，儀器編號(hào)：20050017；北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TU－1810 紫 外－可見分光光度計(jì)，儀器編號(hào)：20040425。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物及分組 18只健康C57BL／6J小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22g，購自重慶第三軍醫(yī)大大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）2012－0001。飼養(yǎng)于光照－黑暗12h交替（光照期6：00～18：00）的SPF程控環(huán)境，自由飲水進(jìn)食，動(dòng)物房室溫維持在23℃左右。適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后全部小鼠隨機(jī)分為正常組6只，肝癌組12只。

1.2.2 造模及取材 參考有關(guān)文獻(xiàn)［3］，取肝癌組小鼠先一次腹腔注射DEN 100mg／kg，3d后以CCl4和橄欖油（20∶80）灌胃，0.05mL／10g，2次／w；第3周再腹腔注射DEN 1次（50mg／kg），同時(shí)開始給予含有9%乙醇的飲用水，第4周加大CCl4劑量至0.08mL／10g，正常組僅自由飲用滅菌普通水，觀察兩組小鼠活動(dòng)情況，連續(xù)16w后于10：00處死動(dòng)物。取正常組（正常組織）、肝癌組（癌旁組織和癌組織）組織備用。

1.2.3 Real－Time RT－PCR 檢測(cè)基因的表達(dá) 取50～100mg的正常肝組織、癌旁組織、癌組織分別置于1mL Trizol中勻漿，加入200μL的氯仿，震蕩混勻，12 000r／min，4℃離心10min。吸取上清300μL轉(zhuǎn)入另外去酶EP管中，加等量異丙醇混勻后，12 000r／min，4℃離心10min，棄去上清，使用75%乙醇（DEPC水配置）在7 500r／min，4℃離心5min情況下洗滌2次，室溫干燥后加入100μL DEPC水。利用TU－1810紫外－可見分光光度計(jì)測(cè)其260／280比值，檢測(cè)其純度和濃度。采用 High Capacity Reverse Transcriptase Kit逆轉(zhuǎn)錄純化的RNA，所得cDNA利用特異引物（見表1）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件參照試劑盒說明書進(jìn)行。利用G3PDH對(duì)各基因的表達(dá)進(jìn)行歸一化處理。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR底物序列

圖1 肝臟巨檢及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常組織、癌旁、癌組織中AFP表達(dá)?！纒，n＝12，與正常組比較，＊P＜0.05

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常組織、癌旁、癌組織中Bmal1、Dbp和Rev－ErbαmRNA表達(dá)?！纒，n＝12，與正常組比較，＊P＜0.05

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one－way ANOVA），組間比較用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織巨檢及腫瘤標(biāo)志基因AFP mRNA的表達(dá)

肝癌組在16w后巨檢發(fā)現(xiàn)肝表面凹凸不平，散在直徑大小不等的結(jié)節(jié)（見圖1）。甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein，AFP）是原發(fā)性肝癌的高特異性和高靈敏度的腫瘤標(biāo)志物。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，AFP mRNA在癌組織中高表達(dá)，約為正常組織表達(dá)量10倍（P＜0.05）（見圖1），提示肝癌組小鼠已被成功誘發(fā)肝癌。

2.2 時(shí)鐘基因mRNA的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)組已成功檢測(cè)出時(shí)鐘基因Brain muscle ARNT－like protein 1（Bmal1）、albumin site D－binding protein（Dbp）和 Nuclear receptor Rev－erb alpha（Rev－erb）在正常雄性昆明小鼠中 mRNA表達(dá)的節(jié)律性變化（見圖2）。本實(shí)驗(yàn)10：00取材的正常肝組織中Bmal1表達(dá)較高，Dbp和Rev－Erbα表達(dá)較低；而同正常組相比較，Bmal1在癌旁組織、癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），下降到正常組的1／3；Dbp和 Rev－Erbα在癌旁組織、癌組織中mRNA的表達(dá)顯著上升（P＜0.05），達(dá)到正常組的2～4倍（見圖2）；癌旁組織與癌組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠正常肝臟組織的時(shí)鐘基因表現(xiàn)出一定的節(jié)律變化，Bmal1基因的表達(dá)量在10：00較高，Dbp和 Rev－Erbα在10：00僅有少量表達(dá)。這與本實(shí)驗(yàn)組近期的研究結(jié)果［4，7］相一致。經(jīng)DEN誘導(dǎo)C57BL／6J小鼠肝癌形成的條件下，其癌旁組織和癌組織的時(shí)鐘基因的節(jié)律已顯示出紊亂。Bmal1基因表達(dá)量顯著下調(diào)，Dbp和Rev－Erbα的表達(dá)量明顯上升。

節(jié)律性的生命活動(dòng)廣泛存在于各種生物體中，從單細(xì)胞生物到植物、動(dòng)物直至人類，都受到時(shí)鐘基因的調(diào)控。目前已知有很多的時(shí)鐘基因參與了生物體節(jié)律活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如：Bmal1、Dbp和 Rev－Erbα等。Bmal1在哺乳動(dòng)物生物鐘的轉(zhuǎn)錄、翻譯反饋環(huán)中以異源二聚體的形式激活Dbp、Rev－Erbα發(fā)揮重要作用。Dbp、Rev－Erbα表達(dá)蛋白入核又反過來抑制Bmal1的轉(zhuǎn)錄，由于基因轉(zhuǎn)錄和蛋白入核需要一定時(shí)間，這樣就使被調(diào)控的基因呈現(xiàn)出生物節(jié)律［5］。亦有研究［6］表明Rev－Erbα對(duì)維持晝夜節(jié)律的長(zhǎng)度和相位是必須的，并與Dbp及其它因子共同組成鐘控基因小組，用以控制其下游的時(shí)鐘基因。而生物的節(jié)律活動(dòng)并不是僅依靠時(shí)鐘基因來實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)藥物代謝關(guān)鍵酶細(xì)胞色素P450、金屬硫蛋白和抗氧化基因同樣存在晝夜節(jié)律［4，7］，提示了生物節(jié)律的重要性。

時(shí)鐘基因與其它基因共同作用參與機(jī)體的多種生理功能和疾病的病理過程，如：血壓和心肌缺血顯示出節(jié)律性［8］，下丘腦肽類物質(zhì)胃腸肽、促胃液素等也顯示出晝夜周期節(jié)律變化［9］，這都與時(shí)鐘基因的正常調(diào)控存在密切聯(lián)系。更為重要的是時(shí)鐘基因能夠影響細(xì)胞的增殖周期和凋亡、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫功能，這些都與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。因而時(shí)鐘基因的紊亂有可能促使腫瘤發(fā)生，加速腫瘤的發(fā)展［10］。大量研究表明時(shí)鐘基因的紊亂可增高乳腺癌發(fā)病率和結(jié)腸癌的發(fā)生機(jī)會(huì)，同時(shí)與造血系統(tǒng)腫瘤的產(chǎn)生也存在著一定的相關(guān)性。亦有研究顯示在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)褪黑素的周期性改變，在卵巢癌、胃癌中激素分泌存在晝夜節(jié)律的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚顯示在小鼠肝癌組織中時(shí)鐘基因表達(dá)發(fā)生了紊亂。究竟是肝癌的發(fā)生改變了時(shí)鐘基因的節(jié)律性，還是時(shí)鐘基因的紊亂促進(jìn)了肝癌的發(fā)生，或二者均存在，這需要進(jìn)一步的研究去證實(shí)。

DEN在整個(gè)誘癌過程中經(jīng)歷肝細(xì)胞損傷再生到硬化直至癌變的過程，與人類肝癌發(fā)生的經(jīng)歷階段類似［11］，從而彌補(bǔ)了臨床標(biāo)本的不足，為研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)在采用DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌形成的條件下，檢測(cè)出時(shí)鐘基因在癌組織和癌旁組織顯示出紊亂，為時(shí)鐘基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)聯(lián)性的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］王雅平，華魯純，張延齡，等.生物鐘基因與腫瘤［J］.國(guó)際外科學(xué)雜志，2006，33（4）：279－283.

［2］李笑巖，白咸勇，劉同慎，等.二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌模型的建立及病理學(xué)改變［J］.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，30（6）：401－403，406.

［3］匡志鵬，謝裕安，楊帆，等.C57BL／6J小鼠肝癌動(dòng)物模型的建立［J］.中國(guó)普通外科雜志，2007，16（7）：657－660.

［4］Xu YQ，Zhang D，Jin T，et al.Diurnal Variation of Hepatic Antioxidant Gene Expression in Mice［J］.PLoS One，2012，7（8）：e44237.

［5］倪銀華，吳濤，王露，等.腎上腺糖皮質(zhì)激素與生物鐘基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究進(jìn)展［J］.遺傳，2008，30（2）：135－141.

［6］徐祖元.哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律生物鐘的研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)，2004，16（2）：104－108.

［7］Zhang D，Jin T，Xu YQ，et al.Diurnal－and sex－related difference of metallothionein expression in mice ［J］.J Circadian Rhythms，2012，10（1）：1－8.

［8］徐晨，錢睿哲，金惠銘.生物鐘基因與心血管疾?。跩］.中國(guó)病理生理雜志，2006，22（7）：1450－1453.

［9］田愛花.生物鐘基因與胃腸道的關(guān)系［J］.醫(yī)學(xué)新知雜志，2012，22（3）：193－195.

［10］樂凡，葉勝龍.晝夜節(jié)律鐘基因與腫瘤［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2007，14（1）：83－86.

［11］朱艷志，孔憲炳，顏朗，等.間斷給藥DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型建立及病理研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35（12）：1843－1846.