申松希,張 玲,朱世鵬,任曉暄,郭孟瑋,趙雅芳,李曉泓,嵇 波,張露芬,朱 江

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京100029)

原發(fā)性痛經(jīng)(primary dysmenorrheal,PD)是婦科最常見的癥狀之一,是指行經(jīng)前后或月經(jīng)期出現(xiàn)下腹疼痛、墜脹,伴腰酸或其他不適,疼痛程度嚴(yán)重時(shí)影響生活和工作質(zhì)量。寒凝血瘀是痛經(jīng)的主要病機(jī)之一,由于寒冷刺激而引起的機(jī)體內(nèi)血液凝滯,血脈不通,血不歸經(jīng),瘀滯不行,瘀積不散,血泣則不通等病理變化。雖然目前痛經(jīng)的動物模型制作已經(jīng)成熟,但是基于中醫(yī)學(xué)“病證結(jié)合”的“寒凝型痛經(jīng)”模型制作目前報(bào)道尚少。因此本實(shí)驗(yàn)擬采用全身冷凍法觀察對大鼠機(jī)體產(chǎn)生的影響,并觀察寒冷刺激后血液流變學(xué)的變化,以評價(jià)全身低溫冷凍方法制備寒凝證類痛經(jīng)動物模型的適宜時(shí)間。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 本動物實(shí)驗(yàn)過程均遵守美國國立衛(wèi)生院倡導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動物關(guān)懷和使用指導(dǎo)原則和以減少(Reduction)、替代(Replacement)和優(yōu)化(Refinement)為核心的動物實(shí)驗(yàn)“3R”原則。采用清潔級健康Sprague-Dawley(SD)品系雌性大鼠,3月齡,性成熟未交配,體質(zhì)量(240±20)g,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,合格證號:SCXK(軍)2007-004。飼養(yǎng)條件:室內(nèi)溫度(20±1)℃,濕度(45±5)%,日光燈光照,普通清潔級鼠飼料,自由飲用自來水。

1.2 儀器與試劑 儀器:BT223 S電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;電熱恒溫水浴箱,北京市醫(yī)療設(shè)備廠;MDF-u50A型超低溫冷柜,日本三洋公司TX51;顯微鏡,日本Olympus公司。試劑:苯甲酸雌二醇注射液,上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號:040304;縮宮素注射液,上海禾豐制藥廠生產(chǎn),批號:070709;氨基甲酸乙酯,北京篤信精細(xì)制劑廠,批號:0081103。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組 將實(shí)驗(yàn)大鼠編號、標(biāo)記、稱重,通過陰道涂片法隨機(jī)分為4組。每日定時(shí)將3月齡SD雌性大鼠用細(xì)棉簽以生理鹽水濕潤后輕輕插入大鼠陰道約0.5 cm,慢慢轉(zhuǎn)動一下取出,將帶有陰道內(nèi)含物的細(xì)棉簽在載玻片上均勻轉(zhuǎn)動涂片,在空氣中干燥,然后在顯微鏡下觀察陰道涂片的組織學(xué)變化。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、種類及數(shù)量篩選處于動情間期的3月齡SD雌性大鼠39只,按照隨機(jī)數(shù)字法分為4組,分別為:空白對照組10只,類痛經(jīng)模型組10只,冷凍5 d加給藥組10只,冷凍10 d加給藥組織。

2.2 模型制備 空白對照組為室溫(20±1)℃,動物房內(nèi)飼養(yǎng),同步抓取不做任何處理。類痛經(jīng)模型組,依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[1]并加以改進(jìn)。類痛經(jīng)模型組,每日給予大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液,連續(xù)10 d,第1天及第10天每日注射0.5 mg/只,第2～9天每日0.2 mg/只,末次給藥1 h后,腹腔注射縮宮素2 u/只。寒凝證類痛經(jīng)模型組,采用寒凝證模型結(jié)合類痛經(jīng)模型的造模方法。冷凍5 d加給藥組,給予皮下注射苯甲酸雌二醇連續(xù)10 d,第1天及第10天日注射0.5 mg/只,第2～9天每日0.2 mg/只,末次給藥1 h后,腹腔注射縮宮素2 u/只。每天在注射以后,大鼠放入低溫冷柜(-25℃)冷凍,持續(xù)受凍4 h左右,中間間隔2 h開蓋通氣5 s,連續(xù)凍5 d;冷凍10 d加給藥組,每日在給藥后大鼠放入低溫冷柜,在-25℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4 h左右,中間間隔2 h開蓋通氣5 s,連續(xù)凍10 d。

2.3 血液流變學(xué)檢測 所有大鼠處理后均上午取材。肌注20%氨基甲酸乙酯(0.7 mL/100 g)麻醉大鼠,剖開大鼠腹腔,暴露腹主動脈,取出血液5 mL,置于肝素抗凝管內(nèi)。送環(huán)宇金科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(北京)有限公司,血液流變學(xué)指標(biāo)檢測采用MVIS-2040全自動血液流變儀。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 寒凝證模型大鼠全血黏度的變化 與對照組比較,冷凍5 d加給藥組的全血黏度低切和高切有所升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 全血黏度的變化(±s) mpa·s

表1 全血黏度的變化(±s) mpa·s

組 別 n 全血黏度低切全血黏度中切全血黏度高切空白對照組 10 27.87±2.1017.94±0.76 13.77±1.45類痛經(jīng)組 10 27.59±1.9417.47±0.31 13.78±0.71冷凍5 d加給藥組 10 28.02±2.8917.50±0.65 13.80±0.56冷凍10 d加給藥組 9 27.56±2.5917.01±1.08 12.79±1.08

3.2 寒凝證模型大鼠全血還原黏度的變化 見表2。

表2 全血還原黏度的變化(±s) mpa·s

表2 全血還原黏度的變化(±s) mpa·s

注:與對照組比較,#P<0.05。

組 別 n 全血黏度低切全血黏度中切全血黏度高切空白對照組 10 48.62±2.8030.98±2.19 21.10±1.84類痛經(jīng)組 10 47.76±2.9531.01±1.94 23.35±1.63#冷凍5 d加給藥組 10 48.79±4.7532.25±2.82 24.10±2.51#冷凍10 d加給藥組 9 48.75±3.5429.63±3.27 21.05±2.47

3.3 寒凝證模型大鼠紅細(xì)胞壓積、聚集指數(shù)、電泳,剛性指數(shù)的變化 見表3。

表3 紅細(xì)胞壓積、聚集指數(shù)、電泳,剛性指數(shù)的變化(±s)

表3 紅細(xì)胞壓積、聚集指數(shù)、電泳,剛性指數(shù)的變化(±s)

注:與對照組比較,#P<0.05。

組 別 n 紅細(xì)胞壓積紅細(xì)胞聚集指數(shù)紅細(xì)胞電泳剛性指數(shù)空白對照組 1053.90±3.14 2.07±0.323.87±0.45 12.15±1.86類痛經(jīng)組 1052.70±1.49 2.67±0.734.39±0.95 12.82±1.08冷凍5 d加給藥組 1051.80±2.30 2.82±1.094.95±1.7213.90±1.36#冷凍10 d加給藥組 9 52.33±2.45 2.24±0.304.38±0.7812.17±1.46

4 討論

原發(fā)性痛經(jīng)(PD)屬中醫(yī)學(xué)中“經(jīng)行腹痛”范疇,與胞宮、肝、腎、脾、沖任督脈關(guān)系密切,主要病機(jī)為氣血運(yùn)行不暢,沖任失調(diào),而導(dǎo)致“不通則痛”和“不榮則痛”。寒濕凝滯證是臨床常見的證型之一,因經(jīng)期冒雨、涉水、游泳或經(jīng)期貪食生冷,內(nèi)傷于寒,或生活于濕地,風(fēng)冷寒濕客于沖任、胞中,以致經(jīng)血凝滯不暢。寒凝與全身或局部的血液循環(huán)障礙有關(guān),中醫(yī)認(rèn)為血“得溫則行,逢寒則凝”。寒則凝,凝則成瘀,故寒邪易致寒凝血瘀。根據(jù)這一理論,本課題探索了寒凝證模型的制備方法。

資料[2-3]證明,寒凝證一般都伴有血液流變學(xué)異常,血液流變學(xué)異常時(shí)可出現(xiàn)血瘀證,產(chǎn)生血瘀證是由于血流成分與性狀改變,而致黏、濃、聚、凝?！梆ぁ笔侵溉ざ?、血漿黏度增加;“濃”是指紅細(xì)胞壓積、三酰甘油、膽固醇、球蛋白、脂蛋白增加;“凝”則指血液凝固性增加,纖維蛋白原含量增加,纖溶活性降低,血漿復(fù)鈣時(shí)間縮短;“聚”是指紅細(xì)胞及血小板在血漿中電泳速度減慢,血小板對ADP類誘導(dǎo)物質(zhì)的聚集性增加。其形成機(jī)理是由于寒冷的侵襲而使交感神經(jīng)興奮,引起血管壁損傷,使血管通透性增加,而丟失較小的蛋白分子。此外,由于持續(xù)的寒冷刺激,引起血管平滑肌收縮及血管壁損傷,使血栓素增加,血小板聚集功能亢進(jìn),機(jī)體全身血液流變性和凝血機(jī)制失調(diào),成為濃、黏、聚狀態(tài)。

據(jù)文獻(xiàn)記載,寒凝模型造模方法主要有局部凍傷法、全身冷凍法、風(fēng)寒環(huán)境法、冰水浸泡法、冰水浸泡加藥物法、冷刺激法、寒涼中藥法等方法[4-6]。本實(shí)驗(yàn)在查閱大量文獻(xiàn)基礎(chǔ)上采用并改良全身冷凍方法和注射苯甲酸雌二醇、縮宮素結(jié)合的方法造成寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型,冰凍溫度為-25℃,時(shí)間為4 h,中間間隔2 h開蓋通氣5 s,以保證大鼠有充足的氧氣,連續(xù)冷凍5、10 d。此時(shí)大鼠出現(xiàn)畏寒喜暖,蜷縮少動,朦朧欲睡,反應(yīng)遲鈍,呼吸微弱,皮毛蓬松豎立,小便色淡,大便溏,耳色暗紅,爪尾部紫暗腫脹、甚則尾部皮膚破爛等癥狀。寒凝類痛經(jīng)模型組大鼠除引起上述局部紫紺、腫脹、瘀血外,亦可引起全身反應(yīng)主要是血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)異常,全血黏度、全血還原黏度升高,剛性指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞電泳均有不同程度增加等說明確有“寒凝血瘀”之癥。本實(shí)驗(yàn)所取的全身冷凍方法是將模擬的病因病機(jī)、癥狀及血液流變學(xué)檢查融為一體建立的動物模型。模擬病因病機(jī):根據(jù)中醫(yī)病因病機(jī)采用冷凍致寒凝,寒為陰邪、寒入于經(jīng),經(jīng)脈拘急,血得寒則凝,可致血液凝滯,運(yùn)行不暢而成寒凝血瘀,血液凝澀而不能暢通;模擬癥狀:大鼠出現(xiàn)畏寒蜷縮弓背,精神萎靡,反應(yīng)遲鈍,行動緩慢 ,毛松豎起脫落 ,耳 、尾、爪 、舌紫暗 ,體溫下降 ;血液流變學(xué):寒凝模型組的全血還原黏度和剛性指數(shù)明顯升高,與對照組比較差異顯著。結(jié)果顯示,寒凝證類痛經(jīng)大鼠模型,與對照組比較,血流指標(biāo)均有升高趨勢,證明寒凝證類痛經(jīng)的制備方法穩(wěn)定可靠。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)采用模擬病因、癥狀表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)指標(biāo)等方面綜合評價(jià)方法證明了寒凝證結(jié)合類痛經(jīng)的制備方法可行,模型制備簡便實(shí)用,符合中醫(yī)證候特點(diǎn),也與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)相一致。

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