劉一劍 譚祖松 鄧晉 黃琿 馮宏達(dá) 謝哲 游詠

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一組因冠狀動脈粥樣硬化致使血管腔狹窄、阻塞或功能性改變?nèi)绻诿}痙攣導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病變，是動脈粥樣病變中最常見的類型，也是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。其病理改變在本質(zhì)上是動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）。然而AS的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。近年來，國外相關(guān)研究顯示，HBEGF在肺組織、骨骼肌組織、腦組織、心肌組織、脂肪組織等多個(gè)組織中表達(dá)，尤其在脂肪組織中高表達(dá)，具有廣泛的生物學(xué)活性，然國內(nèi)對該研究仍不多。TGF-β1參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和狹窄、心肌梗死后重塑、細(xì)胞凋亡等過程，是冠心病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但在冠心病過程中的作用尚未完全闡明，仍有爭議[1-3]。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)分析HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA在冠心病患者血清中的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析兩者在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用，希望能為冠心病從分子基因水平的防治提供新思路、新途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年-2013年住院病例，入院診斷考慮冠心病并通過冠狀動脈造影確診患者60例，其中ACS組30例、SAP組30例，并選取同期經(jīng)詳細(xì)詢問病史、體格檢查及胸片、心電圖、血、尿、大便常規(guī)、血生化檢查均未見異常及選擇性冠脈造影（CAG）無血管病變者出院修正診斷為健康人或心臟神經(jīng)官能癥20例作為對照組（NC組）。所有入組病例均排除嚴(yán)重肝腎腦肺疾病、嚴(yán)重瓣膜性心臟病、心肌病、風(fēng)心病、肺源性心臟病患者、重癥感染、甲亢、活動性結(jié)核、近1個(gè)月內(nèi)應(yīng)用激素或其他免疫抑制劑、腫瘤、自身免疫疾病、感染性疾病或感染急性期、銀屑病、妊娠、近期皮膚及組織損傷等病患。

1.2 試劑 血液RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq MasterMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、100bp Ladder Marker試劑盒（上述試劑均購自北京康為世紀(jì)生物公司）；PCR引物及PCR反應(yīng)體系mix由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 CHD診斷標(biāo)準(zhǔn) 按2007年美國心臟病學(xué)會（American College of Cardiology，ACC）/美國心臟協(xié)會（American Heart Association，AHA）冠心病指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 基本指標(biāo)的測量 身高及體重測量：要求選用同一身高體重計(jì)測量，所有對象均應(yīng)于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，穿單衣單褲、赤腳，腳跟、骶骨部及兩肩胛間緊靠身高計(jì)立柱上。連續(xù)測兩次取其平均值。計(jì)算體重指數(shù)（BMI 體重公斤數(shù)除以身高米數(shù)平方）。血壓測量：所有對象均應(yīng)于清晨醒后、空腹未服用藥物、情緒平穩(wěn)、未運(yùn)動狀態(tài)下測量，連續(xù)3 d清晨測量2次，取平均值；測量方法：選用汞柱式血壓計(jì)，根據(jù)柯氏音第一音及消失音時(shí)水銀柱凸面相應(yīng)垂直高度紀(jì)錄相應(yīng)收縮壓及舒張壓，取平均動脈壓（MAP），平均動脈壓=（收縮壓+2×舒張壓）/3。

1.3.3 血脂測定 所有患者均于入院后第1天清晨空腹采外周靜脈血，測定其甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白膽（LDL），所有標(biāo)本使用德國羅氏全自動生化儀測定。

1.3.4 外周血提取RNA 所有患者均取自于外周動脈血（用檸檬酸鹽、EDTA或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品），所取標(biāo)本按購買試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行RNA提取，提取過程中保持無菌原則，取1 μL RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。并予紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量，要求OD260/OD280于1.8～2.2之間。

1.3.5 RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 提取RNA后立即行逆轉(zhuǎn)錄，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行，所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱。

1.3.6 RT-PCR 收集所有標(biāo)本后進(jìn)行RT-PCR。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL、Mix 10 μL、各基因上、下游引物分別1 μL、RNase-Free Water 6 μL。HBEGF反應(yīng)參數(shù)：94 ℃變性5 min后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件：94 ℃ 30 s，49 ℃ 40s，72 ℃ 40 s；最后 72 ℃終延伸 2 min。TGF-β1反應(yīng)參數(shù)：94 ℃變性5 min后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件：94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，最后 72 ℃終延伸2 min。內(nèi)參β-actin反應(yīng)參數(shù)：94℃變性4 min后進(jìn)行26個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件：94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物直接用于下列電泳或4 ℃保存。PCR儀（型號：德國biometra T-Gradient），見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.7 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析 配制1.5%瓊脂糖凝膠，取PCR目的基因產(chǎn)物及β-actin各3 μL點(diǎn)樣后進(jìn)行電脈，設(shè)置恒壓為90 V，約30 min后結(jié)束電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)（型號：美國alpha3400）觀察結(jié)果，拍照后測定DNA擴(kuò)增帶光密度值，取目的基因光密度值與相應(yīng)β-actin光密度值之比作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，實(shí)驗(yàn)組與對照組間檢驗(yàn)其正態(tài)性方差齊性，各組之間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析，并采用Pearson相關(guān)分析、Spearman等級相關(guān)法對其他可能相關(guān)因素進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHD組與NC組比較 CHD組患者中HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA明顯高于對照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.2 ACS組與SAP組各項(xiàng)指標(biāo)比較 ACS組患者中HBEGF mRNA及TGF-β1mRNA明顯高于SAP組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3及圖1-2。

2.3 HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA在血清中表達(dá)與血壓、血脂的相關(guān)性 結(jié)果示體重指數(shù)、平均動脈壓、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白與HB-EGF mRNA表達(dá)無明顯相關(guān)性，亦與TGF-β1mRNA表達(dá)無明顯相關(guān)性，見表4。

3 討論

HB-EGF是表皮生長因子家族成員之一，是多種類型細(xì)胞有絲分裂原，亦涉及許多生理和病理過程，包括心臟發(fā)育及心肌修復(fù)、心肌肥大、皮膚傷口愈合、眼瞼形成、腎集合管生成、胚泡著床、肺動脈高壓、腫瘤形成等。HB-EGF在動脈粥樣硬化、平滑肌細(xì)胞增生中有重要作用。研究表明，HB-EGF與胞膜上表皮生長因子受體（EGFR）、硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）緊密結(jié)合，通過蛋白激酶C和Ca2+等信號途徑發(fā)揮作用，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞增生[4]。Kishida K等[5]人研究發(fā)現(xiàn)，在AS斑塊組織中，HB-EGF在VSMC和巨噬細(xì)胞的表達(dá)顯著提高，促進(jìn)動脈硬化，而在非AS成人動脈中，內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞HB-EGF呈均勻分布，且隨著年齡的增加而緩慢增加。Reape等[6]在AS斑塊組織HB-EGF的表達(dá)和定位的研究中發(fā)現(xiàn)，對比正常和AS的血管壁，HB-EGF mRNA只在AS組織和用其培養(yǎng)的VSMC中表達(dá)，在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)最后結(jié)果證實(shí)，在冠心病患者血清中，HB-EGF在基因轉(zhuǎn)錄水平較正常對常組明顯增高。還發(fā)現(xiàn)HB-EGF的信號通道比較復(fù)雜，近年來HB-EGF與腫瘤和心血管疾病的發(fā)生機(jī)制的研究日趨活躍，通過對信號通道的研究有望開發(fā)出以HB-EGF為靶向因子的新型藥物治療方式。最新的兩項(xiàng)關(guān)于動脈粥樣硬化免疫組化的臨床研究均發(fā)現(xiàn)[7-8]，HB-EGF

在斑塊局部呈陽性表達(dá)，證實(shí)HB-EGF能刺激平滑肌細(xì)胞細(xì)胞的增殖，遷移，從而在動脈粥樣硬化形成的過程中發(fā)揮作用。這與本文的研究結(jié)果一致。因此，筆者可以推斷在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展過程中，HB-EGF可作為動脈粥樣硬化治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

表2 CHD組與NC組各項(xiàng)指標(biāo)比較

續(xù)表2

表3 ACS組與SAP組各項(xiàng)指標(biāo)比較

續(xù)表3

圖1 ACS、SAP、NC血清中HB-EGF mRNA表達(dá)情況

圖2 TGF-β1 mRNA表達(dá)情況

表4 HB-EGF mRNA及TGF-β1 mRNA在血清中表達(dá)與血壓、血脂及兩者之間的相關(guān)性分析

TGF-β1是TGF-β超家族成員之一，其參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和狹窄、心肌梗死后重塑、細(xì)胞凋亡等過程，是冠心病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但在冠心病過程中的作用尚未完全闡明且有較多爭議。Argmann等[9]在小鼠動脈粥樣硬化模型中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以抑制巨噬細(xì)胞LDL殘?bào)w或氧化的極低LDL殘?bào)w，減少高密度脂蛋白（HDL）與巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的結(jié)合。Kenny等[10]在反復(fù)阻塞和再灌注發(fā)作時(shí)冠狀動脈內(nèi)注射TGF-β1，明確發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)血管壁細(xì)胞的分化，促進(jìn)微血管成熟和血管新生。Tashiro等[11]研究證實(shí)低水平的TGF-β1可促進(jìn)PDGF-α的表達(dá)，介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖；當(dāng)其水平較高時(shí)，平滑肌細(xì)胞表面的PDGF受體α亞單位的表達(dá)受抑制，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖；其不僅能調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的遷移與增殖，而且能調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，對動脈脈粥樣硬化起到保護(hù)作用。本研究最后結(jié)果進(jìn)一步映證，冠心病患者血清中TGF-β1表達(dá)明顯較對照組明顯降低，提示高水平的TGF-β1對冠心病患者可有一定保護(hù)作用。

不穩(wěn)定性粥樣斑塊破裂或脫落并繼發(fā)性出血栓形成是急性冠脈綜合征的重要病理基礎(chǔ)，不穩(wěn)定性斑塊所占比例越高，發(fā)生ACS可能越大。不穩(wěn)定斑塊多為薄而偏心性纖維帽，內(nèi)含有大片脂質(zhì)壞死中心并有大量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞外基質(zhì)及平滑肌細(xì)胞很少。而纖維帽厚，脂質(zhì)壞死中心小，基質(zhì)及平滑肌細(xì)胞多而炎性細(xì)胞少的斑塊強(qiáng)度大，不易破裂，發(fā)生ACS事件偏少。Ross[12]教授提出“AS是一種炎癥性疾病”學(xué)說，指出AS是具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程，其發(fā)展始終伴隨炎癥反應(yīng)。研究表明，TGF-β1可在體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)大的非特異性抗炎作用[13-14]。本研究結(jié)果提示在ACS組患者中，其TGF-β1表達(dá)較SAP組患者明顯偏低，提示TGF-β1可能參與AS炎癥過程，進(jìn)一步印證Ross教授的“AS是一種炎癥性疾病”學(xué)說。

綜上所述，HB-EGF在冠心病患者中明顯增高，其可能作為其發(fā)生、發(fā)展過程中獨(dú)立危險(xiǎn)因素而存在。而TGF-β1則可能AS發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)揮獨(dú)特抗炎作用。本研究結(jié)果提示，血脂及血糖與HB-EGF mRNA及TGF-β1mRNA并無明顯相關(guān)聯(lián)系。因入院前患者有部分服用降脂藥物及飲食中糖及脂含量未做進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，仍須在臨床工作中進(jìn)一步分析觀察。同時(shí)對其相關(guān)機(jī)制仍須進(jìn)一步研究探討。

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