馮延?jì)?，?鴻，2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢430070;2.天津農(nóng)學(xué)院園藝系，天津300384)

擬南芥(Arabidopsis thaliana)胚后發(fā)育主要分為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和生殖生長(zhǎng)階段。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，莖頂端分生組織(shoot apical meristem，SAM)主要形成節(jié)間較短的蓮座葉，這個(gè)階段又可分為幼齡期(juvenile phase)和成熟期(adult phase)，進(jìn)入成熟期后才可過(guò)渡到后一個(gè)生長(zhǎng)階段［1］。在生殖生長(zhǎng)階段，它的起始主要表現(xiàn)在莖節(jié)間明顯加長(zhǎng)，同時(shí)出現(xiàn)可見(jiàn)花芽。

最早關(guān)于植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的研究是在木本植物蘋(píng)果(Malus domestica)和梨(Pyrus communis)中進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)表明接穗的老熟程度對(duì)嫁接的效果有影響，說(shuō)明植物的營(yíng)養(yǎng)特性與它將來(lái)的生殖能力相關(guān)［2］。大量研究表明植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變具有特異性［3，4］，如葉片細(xì)胞大小變化，葉片的長(zhǎng)寬比值變化，成熟時(shí)期相鄰葉片之間呈現(xiàn)出相對(duì)固定的角度，某些植物具有幼齡期和成熟期不同的異形葉［5］，表皮毛(trichomes)的分布和密度等。盡管在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段發(fā)生的特異性變化比較復(fù)雜，但是基于這些變化，可以區(qū)分出植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的節(jié)點(diǎn)［6-9］。然而對(duì)于植株?duì)I養(yǎng)發(fā)育過(guò)程中幼齡期和成熟期的形態(tài)結(jié)構(gòu)、解剖結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)觀測(cè)還不夠全面［10］。

自然界中，遺傳因素和環(huán)境條件共同影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育。擬南芥有4種開(kāi)花途徑:光周期途徑(photoperiod pathway)、春化途徑(vernalization pathway)、自主開(kāi)花途徑(autonomous pathway)和赤霉素途徑(GA pathway)［11］。光周期途徑是這些途徑中最為古老和保守的途徑。不同種類的植物依賴一定的晝長(zhǎng)或夜長(zhǎng)而開(kāi)花，據(jù)此可分為長(zhǎng)日照植物，短日照植物和兼性長(zhǎng)日照植物。擬南芥屬于兼性長(zhǎng)日照植物，在長(zhǎng)日條件下提早開(kāi)花，短日條件下推遲開(kāi)花。光周期途徑中有兩個(gè)比較重要的基因CONSTANS(CO)和FLOWERING LOCUS T(FT)。CO基因在光周期途徑的下游可將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為開(kāi)花信號(hào)，是這條途徑的關(guān)鍵基因［12］。在長(zhǎng)日照條件下，CO基因因受到生物鐘節(jié)律的調(diào)控，在葉片中表達(dá)，它的產(chǎn)物能夠促進(jìn)開(kāi)花轉(zhuǎn)變基因FT的表達(dá)。這樣FT由CO誘導(dǎo)之后，它的產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)會(huì)從葉脈轉(zhuǎn)移到SAM處，誘導(dǎo)開(kāi)花。這兩個(gè)基因突變后，擬南芥表現(xiàn)為晚花。本文利用擬南芥這兩個(gè)基因的突變體co-2和ft-1，研究了光周期途徑晚花突變對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變(vegetative phase change，VPC)的影響，為開(kāi)花與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥Ler生態(tài)型的種子由作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室須健老師課題組提供，co-2和ft-1晚花突變體的種子購(gòu)自Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State University(Columbus，Ohio)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物生長(zhǎng)條件

種子播種前，先放入4℃冰箱中處理2 d。之后點(diǎn)種到小塑料盆中，做好標(biāo)記，蓋上薄膜以保濕，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。光照時(shí)間為16 h，黑暗時(shí)間為8 h，白天溫度22℃，夜間18℃，濕度為60% ～80%。一個(gè)星期后，掀開(kāi)薄膜。

1.2.2 植物生長(zhǎng)觀測(cè)

待種子萌發(fā)后，觀察表型，記錄植株的生長(zhǎng)速率。統(tǒng)計(jì)至少50棵植株的萌發(fā)時(shí)間，觀測(cè)真葉上開(kāi)始出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛的葉片數(shù)，蓮座葉總數(shù)，出現(xiàn)可見(jiàn)花芽的時(shí)間以及整個(gè)生活史過(guò)程等。計(jì)數(shù)近軸面表皮毛的數(shù)目，同時(shí)進(jìn)行密度分析。測(cè)量葉的長(zhǎng)寬比值，并制作曲線圖。植株開(kāi)出第一朵花時(shí)拍照，同時(shí)拍攝兩片子葉、所有的蓮座葉圖片，進(jìn)行葉形分析。

1.2.3 石蠟切片

根據(jù)出現(xiàn)的葉片總數(shù)進(jìn)行取材，包括出現(xiàn)可見(jiàn)葉原基和已有真葉，分別取植株葉片總數(shù)為2，3，4……直至長(zhǎng)出所有蓮座葉的莖尖，F(xiàn)AA固定液固定24 h后，愛(ài)氏蘇木精整染2 d，梯度乙醇脫水，氯仿透明，浸蠟包埋，Leica RM2235切片機(jī)切片，厚度7 μm，中性樹(shù)膠封片，Olympus BX53顯微鏡觀察，Spot Flex CCD相機(jī)拍照，測(cè)量莖端分生組織高與寬的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)延遲揭示co-2和ft-1的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變被延遲

為探討植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變和生殖生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的相關(guān)性，我們觀測(cè)了晚花突變體co-2和ft-1的生長(zhǎng)周期特征。結(jié)果表明，兩種晚花突變體的開(kāi)花時(shí)間與野生型相比，明顯延遲。同時(shí)，我們從野生型和突變體中各選50株統(tǒng)計(jì)了蓮座葉的葉片數(shù)目和出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛的葉片數(shù)目。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，野生型Ler蓮座葉葉片數(shù)目為6.1±0.5，co-2的為14.7±1.8，ft-1的為12.9±0.8，說(shuō)明晚花突變體葉片增多，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期增長(zhǎng);Ler第3.5±0.5片葉未出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛，co-2的是4.0±0.0片，ft-1的是4.0±0.2片，即野生型是從第4片真葉開(kāi)始長(zhǎng)出遠(yuǎn)軸面表皮毛，兩種晚花突變體是從第4片真葉開(kāi)始出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛的，說(shuō)明晚花突變體的遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)晚于野生型，依據(jù)Telfer等觀察結(jié)果，擬南芥中遠(yuǎn)軸面表皮毛的出現(xiàn)是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)幼齡期到成熟期時(shí)相轉(zhuǎn)變的標(biāo)志，所以co-2和ft-1的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)幼齡期得到增長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變被延遲，突變體幼齡期持續(xù)的時(shí)間也比野生型多了數(shù)天(表1)，說(shuō)明晚花突變體co-2和ft-1開(kāi)花轉(zhuǎn)變與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變相關(guān)聯(lián)。

表1 擬南芥野生型和晚花突變體重要生長(zhǎng)時(shí)間段的統(tǒng)計(jì)Table 1 Growth characteristics of Arabidopsis wild-type and late-flowering mutants

2.2 葉形和葉片長(zhǎng)寬比變異顯示co-2和ft-1的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)幼齡期延長(zhǎng)

研究表明，葉形和葉片長(zhǎng)寬比隨著發(fā)育的進(jìn)程而變化。我們比較了野生型和co-2、ft-1突變體的葉形變化。結(jié)果顯示，野生型的子葉和生長(zhǎng)早期的蓮座葉(第1、2、3片)接近圓形，后期的葉片稍呈卵形，生長(zhǎng)出遠(yuǎn)軸面表皮毛的第4片葉與之前的蓮座葉相比變化明顯;co-2和ft-1兩種突變體的一對(duì)子葉和生長(zhǎng)早期的蓮座葉(第1、2、3、4片)也接近圓形，而后期的葉片呈匙形并急劇趨于披針形，co-2和 ft-1生長(zhǎng)出遠(yuǎn)軸面表皮毛的第5片葉與之前的蓮座葉相比變化明顯，莖生葉葉形在野生型和突變體中一致(圖1)。這些結(jié)果表明，隨著植物生長(zhǎng)的進(jìn)程，葉形發(fā)生了由圓形至卵形至披針形的變化，由于生長(zhǎng)周期增長(zhǎng)，這一點(diǎn)在晚花突變體中表現(xiàn)更劇烈、明顯，且這一連續(xù)變化性狀在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)由以遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)為界定的幼齡期向成熟期轉(zhuǎn)變過(guò)程中表現(xiàn)出由圓形到卵形或匙形變化的明顯不同，從葉形特征來(lái)分析，co-2和ft-1突變體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)幼齡期向成熟期轉(zhuǎn)變過(guò)程也被延遲。此外，我們測(cè)定了葉片長(zhǎng)寬比，結(jié)果顯示，最初兩片蓮座葉的長(zhǎng)寬比值幾乎均為1，表明第一對(duì)真葉葉形接近于圓形;隨后，野生型和突變體的葉片長(zhǎng)寬比值都變大，說(shuō)明蓮座葉在不斷變長(zhǎng)。

圖1 Ler和co-2，ft-1的葉形圖Fig 1 Leaf morphology of Ler and co-2，ft-1

2.3 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的莖端分生組織特征決定

為探討植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的解剖結(jié)構(gòu)特征，我們對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期莖端分生組織的特征決定進(jìn)行了解剖觀察。結(jié)果表明，SAM在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育的早期呈稍隆起狀，隨后中央凸起，呈錐體狀，即將開(kāi)花時(shí)又變得較為平坦，由最初的營(yíng)養(yǎng)莖頂端分生組織轉(zhuǎn)變成花序分生組織，然后產(chǎn)生花分生組織，最終形成花芽(圖3)。我們還測(cè)定了SAM的高與寬的比值(圖4)。結(jié)果顯示，無(wú)論是野生型還是晚花突變體，它們的高度值都要比寬度值小，由于SAM剛開(kāi)始呈錐體狀，到后期變得較為平緩，因此高與寬的比值上升到一定階段會(huì)下降。Ler在第4片真葉時(shí)，高寬比值明顯上升，與出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛的葉片位置一致;同樣，兩種突變體在第5片真葉位置時(shí)高寬比值明顯上升。這些結(jié)果表明，在幼齡期到成熟期時(shí)相轉(zhuǎn)變過(guò)程中，莖端分生組織錐體增高明顯，轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)后趨于平緩，晚花突變體co-2和ft-1的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變晚于野生型Ler。

圖4 SAM高與寬的比值測(cè)量結(jié)果圖Fig 4 Height/width ratio of SAM

3 討論

許多植物中形態(tài)發(fā)育的變化常預(yù)示著植株的成熟變化［13，14］。這種變化在某些木本植物和藤本植物中主要是出現(xiàn)異形葉性［5］，而在草本植物中多是以遠(yuǎn)軸面表皮毛的密度和分布為標(biāo)志［7］。為了確定擬南芥植株大小是否影響遠(yuǎn)軸面表皮毛的分布，Telfer等檢測(cè)了與開(kāi)花相關(guān)的突變體psd，amp1－1和amp1(cop2)的表型，發(fā)現(xiàn)它們與野生型比較，突變體上出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛的葉片數(shù)目不同，但出現(xiàn)的時(shí)間卻差不多，說(shuō)明這種變化可能主要影響葉的起始速率［7］;其它晚花突變體的研究表明，葉片出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛與野生型比較明顯推遲，預(yù)示著很多植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變是與植物獲得生殖能力相關(guān)的［10，14］。研究表明，遠(yuǎn)軸面表皮毛的產(chǎn)生受到環(huán)境和與開(kāi)花時(shí)間相關(guān)的突變體的影響［7］。然而，關(guān)于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的相關(guān)研究尚缺乏形態(tài)學(xué)的系統(tǒng)觀察，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的莖端分生組織特征決定也不清楚。為此我們選擇了與光周期途徑相關(guān)的兩種晚花突變體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)表皮毛的類型和分布會(huì)隨莖發(fā)育時(shí)相的變化而變化，葉片除子葉之外，一開(kāi)始就有近軸面表皮毛的出現(xiàn)，并且密度會(huì)隨著葉片的生長(zhǎng)而逐漸加大，但兩種突變體遠(yuǎn)軸面表皮毛卻在生出第5片真葉時(shí)才出現(xiàn)，且最先出現(xiàn)在主脈上，之后才分布到側(cè)脈和葉片上，數(shù)目比近軸面表皮毛少很多;開(kāi)花以后，靠近主花序的莖生葉近軸面表皮毛越來(lái)越少，直到光滑，而遠(yuǎn)軸面表皮毛卻越來(lái)越多。實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是野生型還是晚花突變體，它們的時(shí)相轉(zhuǎn)變相關(guān)特征如葉形，葉片長(zhǎng)寬比值，莖頂端分生組織形態(tài)等表現(xiàn)出的時(shí)相特異性與遠(yuǎn)軸面表皮毛產(chǎn)生的時(shí)間較為吻和。另外，遠(yuǎn)軸面表皮毛的出現(xiàn)很明顯，與木本植物常春藤、合歡等異形葉一樣，是一種質(zhì)量性狀，可作為形態(tài)學(xué)上的量化指標(biāo)，所以擬南芥中可將其作為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的標(biāo)志。與此同時(shí)，突變體較野生型在開(kāi)花時(shí)間上晚了近一倍的時(shí)間，蓮座葉的數(shù)目也比野生型多了一倍，而遠(yuǎn)軸面表皮毛的出現(xiàn)情況，野生型多在第4片真葉上，co-2和 ft-1多在第5片真葉上，說(shuō)明擬南芥晚花突變體延遲了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變。

植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變是生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的序曲，幼齡期進(jìn)入到成熟期后，植物才能感受內(nèi)外界環(huán)境刺激，開(kāi)花結(jié)實(shí)，所以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變對(duì)于植物生殖發(fā)育具有重要影響，其分子遺傳調(diào)控的相關(guān)性也正在取得進(jìn)展。

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